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Krebszellen haben verschiedene Mechanismen entwickelt, um zellulären Stress zu überwinden und sich weiter zu entwickeln.Die Proteinkinase R (PKR) und ihr Proteinaktivator (PACT) sind die ersten Responder, die verschiedene Stresssignale überwachen, die zur Hemmung der Zellproliferation und Apoptose führen.Die Regulation des PACT-PKR-Signalwegs in Krebszellen ist jedoch noch weitgehend unbekannt.Hier fanden wir heraus, dass die lange nicht-kodierende RNA (lncRNA) Aspartyl-tRNA-Synthetase-Antisense-RNA 1 (DARS-AS1) direkt an der Hemmung des PACT-PKR-Signalwegs beteiligt ist und die Proliferation von Krebszellen fördert.Mithilfe eines groß angelegten funktionellen Screenings der krebsassoziierten lncRNA von CRISPRi 971 stellten wir fest, dass DARS-AS1 mit einer signifikant gesteigerten Proliferation von Krebszellen assoziiert war.Daher hemmt der Knockout von DARS-AS1 die Zellproliferation und fördert die Apoptose von Krebszellen in verschiedenen Krebszelllinien in vitro und reduziert das Tumorwachstum in vivo signifikant.Mechanisch bindet DARS-AS1 direkt an die PACT-Aktivierungsdomäne und verhindert die PACT-PKR-Interaktion, wodurch die PKR-Aktivierung und eIF2α-Phosphorylierung reduziert und der apoptotische Zelltod gehemmt wird.Klinisch wird DARS-AS1 in zahlreichen Krebsarten exprimiert, und eine Überexpression dieser lncRNA weist auf eine schlechte Prognose hin.Diese Studie klärt die krebsspezifische Regulierung des PACT-PKR-Signalwegs durch DARS-AS1 lncRNA auf und liefert ein weiteres Ziel für die Krebsprognose und -behandlung.
Die Fähigkeit, sich an Stress anzupassen, ist ein wichtiges Merkmal für das Überleben und die Proliferation von Krebszellen.Die schnelle Proliferation und die metabolischen Kennzeichen von Krebs erreichen ihren Höhepunkt in rauen Mikroumgebungen – Nährstoffmangel, Hypoxie und niedriger pH-Wert –, die Zelltod-Signalwege auslösen können.Eine Dysregulation stressempfindlicher Gene wie p535, Hitzeschockproteine ​​6, 7, KRAS8, 9 und HIF-110, 11, 12, 13 wird häufig bei Krebs beobachtet, wodurch die Apoptose blockiert und das Überleben gefördert wird.
Die Proteinkinase R (PKR) ist ein wichtiger Stresssensor und eine Kinase der Untereinheit des eukaryotischen Initiationsfaktors 2α (eIF2α), eines Translationsregulators, der zellulären Stress mit dem Zelltod verbindet.PKR wurde ursprünglich durch den Nachweis einer fremden doppelsträngigen RNA (dsRNA) als antivirales Protein identifiziert.Nach der Aktivierung phosphoryliert PKR eIF2α, um die virale und zelluläre Proteinsynthese zu hemmen14,15,16.PACT (PKR-Aktivatorprotein) wurde als erstes PKR-Aktivatorprotein in Abwesenheit von dsRNA17,18,19,20,21,22,23 identifiziert.Durch direkte Wechselwirkung mit PKR überträgt PACT verschiedene Stressfaktoren (Serummangel, Peroxid- oder Arsenitbehandlung) auf PKR und nachgeschaltete Signalwege.Zusätzlich zur eIF2α-Phosphorylierung löst die PACT-vermittelte PKR-Aktivierung verschiedene Ereignisse aus, die mit der Stressreaktion verbunden sind, einschließlich eines veränderten Redoxstatus über den PI3K/Akt24-Weg, einer verbesserten DNA-Schadensprüfung über p5325,26 und NF-κB27,28 Reguliert die Transkription, 29. Angesichts ihrer entscheidenden Rolle bei der Stressreaktion, Proliferation, Apoptose und anderen wichtigen zellulären Prozessen sind PKR und PACT vielversprechende therapeutische Ziele für viele Krankheiten, insbesondere Krebs30,31,32,33.Trotz dieser pleiotropen funktionellen und biologischen Bedeutung bleibt die Regulierung der PACT/PKR-Aktivität in Krebszellen jedoch schwer fassbar.
lncRNAs sind Transkripte, die größer als 200 Nukleotide sind und kein proteinkodierendes Potenzial haben.Seit hochmoderne Projekte zur Sequenzierung des gesamten Genoms Tausende von lncRNAs identifiziert haben,35,36 wurden große Anstrengungen unternommen, um ihre biologischen Funktionen aufzuklären.Eine wachsende Zahl von Forschungsarbeiten hat gezeigt, dass lncRNAs an vielen biologischen Prozessen37 beteiligt sind, einschließlich der Regulierung der X-Chromosomen-Inaktivierung38,39, Prägung40, Transkription41,42, Translation43 und sogar des Krebswachstums44,45,46,47.Diese Studien berichteten, dass viele lncRNAs am PACT/PKR-Weg beteiligt sind.Eine solche Studie zeigte, dass lncRNA ASPACT die PACT-Transkription hemmte und die Kernretention von PACT-mRNA erhöhte.Andere Studien haben gezeigt, dass lncRNA nc886 an PKR bindet und dessen Phosphorylierung hemmt49,50.Bisher wurde nicht berichtet, dass lncRNA die PACT-vermittelte PKR-Aktivierung reguliert.
Aspartyl-tRNA-Synthetase-Antisense-RNA 1 (DARS-AS1) wurde als onkogene lncRNA identifiziert51,52,53,54.Durch die Regulation von miP-194-5p53, miP-12952 und miP-532-3p51 fördert DARS-AS1 nachweislich das Wachstum von klarzelligem Nierenzellkarzinom, Schilddrüsenkarzinom bzw. nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom.Tong und Kollegen fanden auch heraus, dass DARS-AS1 das Fortschreiten des Myeloms fördert, indem es die Stabilität des RNA-Bindungsmotivs von Protein 39 (RBM39) aufrechterhält.Es wurden jedoch keine Studien darüber durchgeführt, ob diese lncRNA an der Regulation der PACT-PKR-Aktivierung und der Stressreaktion von Krebszellen beteiligt ist.
Hier haben wir mit dem CRISPRi-System einen groß angelegten Funktionsverlust-Screen durchgeführt und festgestellt, dass die DARS-AS1-lncRNA die Proliferation mehrerer Arten von Krebszellen fördert.Darüber hinaus haben wir einen Hauptmechanismus identifiziert: DARS-AS1 bindet direkt an PACT, hemmt die PACT- und PKR-Bindung, verhindert die Phosphorylierung von eIF2α, einem niedrigeren PKR-Substrat, und hemmt letztendlich den apoptotischen Zelltod.Zusammenfassend zeigt unsere Arbeit, dass die lncRNA von DARS-AS1 ein Regulator des PACT-PKR-Signalwegs und ein potenzielles Ziel für die Krebsbehandlung und -prognose ist.
Umfangreiche genomische Profiling-Studien haben Hunderte von lncRNAs identifiziert, die mit Krebs assoziiert sind.Ihre Funktion ist jedoch noch weitgehend unbekannt56.Um vielversprechende lncRNA-Kandidaten zu identifizieren, die an der Krebsprogression beteiligt sind, führten wir mit dem CRISPRi-System einen Funktionsverlust-Screen für reduzierte Proliferation in der Darmkrebs-Zelllinie SW620 durch (Abb. 1a).Das einzigartige Merkmal der Dickdarmkrebszelllinien SW480 und SW620 besteht darin, dass sie von Primär- und Sekundärtumoren eines einzelnen Patienten stammen.Dies liefert einen wertvollen Vergleich für die Untersuchung genetischer Veränderungen beim Fortschreiten von fortgeschrittenem Dickdarmkrebs.Daher haben wir die Transkriptome von Darmkrebszelllinien (SW480 und SW620) mithilfe von RNA-Sequenzierung analysiert und einige potenzielle funktionelle lncRNAs aus der veröffentlichten Literatur gesammelt.Basierend auf diesen Ergebnissen haben wir eine gepoolte sgRNA-Bibliothek entworfen, die 7355 sgRNA-Oligos enthält, die auf 971 krebsassoziierte lncRNAs und 500 nicht zielgerichtete sgRNA-Oligos für eine Negativkontrolle abzielen (Ergänzungsdaten 1).
Schematische Darstellung des Screenings mit dem CRISPRi-System.b sgRNA-Anreicherung nach Screening.Die horizontale gepunktete Linie repräsentiert log2 (fache Änderung) = ±0,58.Die vertikale gepunktete Linie zeigt den p-Wert = 0,05 an.Schwarze Punkte stellen Nicht-Ziel-sgRNA dar (als NC bezeichnet).Rote Punkte sind sgRNAs, die auf DARS-AS1 abzielen.Blaue Punkte sind sgRNAs, die auf LINC00205 abzielen, eine zuvor beschriebene onkogene lncRNA.fache Änderung = (normalisierter Messwert, Tag 17)/(normalisierter Messwert, Tag 0).c DARS-AS1-sgRNA-Knockdown hemmte das Zellwachstum.Fehlerbalken repräsentieren ± Standardabweichung der drei Experimente.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 zweiseitiger Student-t-Test.d DARS-AS1-Expression in Tumoren (TCGA-Datensatz).em Expression von DARS-AS1 in gepaarten Normal- und Tumorproben von Patienten mit BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP bzw. COAD (TCGA-Datensatz).p-Werte wurden unter Verwendung des gepaarten zweiseitigen Student-t-Tests erhalten.
Nach Konstruktion des Plasmids und Verpackung des Lentivirus transduzierten wir die dCas9-SW620-Darmkrebszelllinie mit der obigen Bibliothek in vier unabhängigen Infektionsexperimenten.Die Infektionsmultiplizität (MOI) für diese Infektionen betrug 0,1–0,3, was darauf hinweist, dass jede Zelle nur mit einer sgRNA transfiziert werden kann.Nach 18 Tagen In-vitro-Kultur nahm das Anreicherungsprofil der Ziel-sgRNAs nach dem Screening ab oder zu, während die Anzahl der nicht zielgerichteten Kontroll-Oligonukleotide im Vergleich zum Profil vor dem Screening relativ unverändert blieb, was darauf hinweist, dass unser Ziel eine hohe Screen-spezifische Eigenschaft aufweist Bibliothek.Reis.1b und Ergänzungstabelle 1). LINC00205, von dem zuvor berichtet wurde, dass es das Fortschreiten von Lungenkrebs und Leberkrebs fördert58,59,60, wurde herausgescreent (log2 (foldchange) < –0,58, p-Wert < 0,05), was die Zuverlässigkeit dieses Screenings bestätigt (Abb. 1b). LINC00205, von dem zuvor berichtet wurde, dass es das Fortschreiten von Lungenkrebs und Leberkrebs fördert58,59,60, wurde herausgescreent (log2 (foldchange) < –0,58, p-Wert < 0,05), was die Zuverlässigkeit dieses Screenings bestätigt (Abb. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, von dem zuvor berichtet wurde, dass es das Fortschreiten von Lungenkrebs und Leberkrebs fördert58,59,60, wurde ausgeschlossen (log2 (fache Änderung) <-0,58, p-Wert <0,05), was die Robustheit dieses Screenings bestätigt (Abb. 1b). . Linc00205 之前 被 报道 促进 肺癌 肺癌 肝癌 进展 进展 58,59,60 ， 筛 选 掉 掉 （log2 （变化））） 可靠性 （图 图 1b））。。。。。。。。。。。。。。。。。。 证实 了 筛选 的 （图）））。。。。。。。。。。。 证实 了 该 筛选 可靠性 （图））。。。。。。 证实 了 该 的 （图））。。。。 ， 证实 了 该 筛选 （，））。。。 ， 证实 了 该 筛选 可靠性 图）））。。. 证实 了 该 筛选 （图 图）））。。。 证实 了 该 筛选 （图 图 图）） Linc00205 之前 被 报道 促进 肺癌 肺癌 肝癌 进展 进展 58,59,60 ， 筛 选 掉 掉 （log2 （变化））） 可靠性 （图 图 1b））。。。。。。。。。。。。。。。。。。 证实 了 筛选 的 （图）））。。。。。。。。。。。 证实 了 该 筛选 可靠性 （图））。。。。。。 证实 了 该 的 （图））。。。。 ， 证实 了 该 筛选 （，））。。。 ， 证实 了 该 筛选 可靠性 图）））。。. 证实 了 该 筛选 （图 图）））。。。 证实 了 该 筛选 （图 图 图）） LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, von dem zuvor berichtet wurde, dass es das Fortschreiten von Lungen- und Leberkrebs fördert58,59,60, wurde ausgeschlossen (log2 (fache Änderung) <-0,58, p-Wert <0,05), was die Robustheit dieses Screenings bestätigt (Abb. 1b).
Unter allen getesteten lncRNAs wurde auch DARS-AS1 gescreent, wobei die drei verwandten sgRNA-Oligonukleotide nach 18 Tagen Kultur signifikant reduziert waren, was darauf hindeutet, dass der Knockdown dieser lncRNA zu einer verringerten Krebsproliferation führte (Abb. 1b).Dieses Ergebnis wurde weiter durch MTS-Analysen in Darmkrebszellen gestützt, die zeigten, dass die Wachstumsrate von DARS-AS1-Knockdown-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen nur halbiert war (Abbildung 1c) und mit früheren Berichten über mehrere andere Krebsarten übereinstimmte.: klarzelliger Nierenkrebs, Schilddrüsenkrebs und nicht-kleinzelliger Lungenkrebs51,52,53,55.Seine Funktion und molekularen Mechanismen bei Darmkrebs bleiben jedoch unerforscht.Daher haben wir diese lncRNA für weitere Untersuchungen ausgewählt.
Um die DARS-AS1-Expression bei Patienten zu untersuchen, haben wir 10.327 Tumorproben aus dem Cancer Genome Atlas (TCGA)-Projekt umfassend analysiert.Unsere Ergebnisse zeigen, dass DARS-AS1 in gesunden Zellen in einer Vielzahl von Tumoren, darunter Dickdarm-Adenokarzinom (COAD), klarzelliges Nierenkarzinom (KIRC) und papilläres Nierenzellkarzinom (KIRP), weit verbreitet und signifikant hochreguliert ist..Sehr wenige (Abb. 1d und ergänzende Abb. 1a, b). Die Analyse von gepaarten gesunden/Tumorproben bestätigte ferner eine signifikant höhere Expression von DARS-AS1 in den Tumoren von Blasen-Urothelkarzinom (BLCA), klarzelligem Nieren-Nieren-Karzinom (KIRC), Prostata-Adenokarzinom (PRAD), Plattenepithelkarzinom der Lunge (LUSC) , Endometriumkarzinom des Corpus uteri (UCEC), Adenokarzinom der Lunge (LUAD), Hepatozelluläres Karzinom der Leber (LIHC), Papillenzellkarzinom der Niere und der Nieren (KIRP) und Adenokarzinom des Dickdarms (COAD) (p-Wert < 0,05) (Abb. 1e–m) . Die Analyse von gepaarten gesunden/Tumorproben bestätigte ferner eine signifikant höhere Expression von DARS-AS1 in den Tumoren von Blasen-Urothelkarzinom (BLCA), klarzelligem Nieren-Nieren-Karzinom (KIRC), Prostata-Adenokarzinom (PRAD), Plattenepithelkarzinom der Lunge (LUSC) , Endometriumkarzinom des Corpus uteri (UCEC), Adenokarzinom der Lunge (LUAD), Hepatozelluläres Karzinom der Leber (LIHC), Papillenzellkarzinom der Niere und der Nieren (KIRP) und Adenokarzinom des Dickdarms (COAD) (p-Wert < 0,05) (Abb. 1e–m) .Die Analyse gepaarter gesunder/Tumorproben bestätigte auch eine signifikant höhere Expression von DARS-AS1 in Tumoren des Blasen-Urothelkarzinoms (BLCA), des klarzelligen Nieren- und Nierenzellkarzinoms (KIRC), des Prostata-Adenokarzinoms (PRAD) und des Plattenepithelkarzinoms der Lunge (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , Endometriumkarzinom des Corpus uteri (UCEC), Adenokarzinom der Lunge (LUAD), hepatozelluläres Karzinom der Leber (LIHC), Papillenzellkarzinom der Niere (KIRP) und Adenokarzinom des Dickdarms (COAD) (p-Wert < 0,05) (Abb. 1e–m) .配对健康/肿瘤样本的分析进一步证实了DARS-AS1 在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、肾肾透明细胞癌(KIRC)、前列腺腺癌(PRAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC) 肿瘤中的" <0,05）（图1e-m） .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 更 高 表达 内膜 癌 （（） 肺腺癌 （luad） 细胞癌 （lihc） 肾 乳头状 乳头状 乳头状 细胞 细胞 细胞 （（（（细胞 细胞 细胞 乳头状 乳头状 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 （（（luad） 细胞癌 lihc） 肾 乳头状 乳头状 乳头状 细胞 （（luad） （lihc） 肾 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 细胞 肺腺癌 （（luad） （lihc癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Die Analyse gesunder/tumorgepaarter Proben unterstützte die Rolle von DARS-AS1 bei Tumoren des Blasen-Urothelkarzinoms (BLCA), des klarzelligen Nierenzellkarzinoms (KIRC), des Prostata-Adenokarzinoms (PRAD) und des Plattenepithelkarzinoms der Lunge (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). Expression in Corpus-Uterus-Karzinom (UCEC), Lungenadenokarzinom (LUAD), hepatozellulärem Karzinom (LIHC), Nierenpapillenzellkarzinom (KIRP) und Dickdarm-Adenokarzinom (COAD) (p-Wert < 0,05) (Abbildung 1e-m).Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass DARS-AS1 bei einer Vielzahl von Krebsarten weit verbreitet und stark exprimiert wird.
Da DARS-AS1 und DARS (das Gen, das den Antisense-Strang codiert) denselben Promotor teilen und nebeneinander liegen, haben wir shRNA entwickelt, um DARS-AS1, aber nicht DARS, spezifisch niederzuschlagen (ergänzende Abb. 2a, b und ergänzende Tabelle 2). .Neben SW620 haben wir auch drei andere Zelllinien verwendet, die DARS-AS1 stark exprimieren, um die Wirksamkeit und Funktion des shRNA-Knockdowns zu untersuchen (Ergänzungstabelle 3).Unsere Ergebnisse zeigten, dass alle drei entwickelten shRNAs eine DARS-AS1-Knockdown-Effizienz von mindestens 80 % erreichten, mit geringer Auswirkung auf die Menge an DARS-mRNA (ergänzende Abb. 2c–f).Darüber hinaus fanden wir heraus, dass der DARS-AS1-Knockdown mit diesen shRNAs das Zellwachstum in den Darmkrebszelllinien SW620 (49,7 %) und HCT116 (27,7 %) sowie der Brustkrebszelllinie MBA-MD-231 (53,4 %) signifikant hemmte.) und der Hepatom-Zelllinie HepG2 (Reduktion um 92,7 %) sowie ihre Fähigkeit, nicht verankerte Kugeln zu bilden (durchschnittliche Reduktion von ~50,8 %, 44,6 %, 40,7 % und 75,7 % pro Zelllinie) (Abb. 2a,b).Bei SW620 bestätigten die Ergebnisse des Koloniebildungsassays weiter, dass DARS-AS1-shRNA die Zellproliferation mit einer durchschnittlichen Abnahme von etwa 69,6 % signifikant hemmte (Abb. 2c).
Wirkung von Kontroll-shRNA und DARS-AS1-shRNA auf die Zellproliferation (a) und Sphäroidbildung (b) in SW620-, HCT116-, MBA-MD-231- und HepG2-Zellen.c Wirkung von Kontroll-shRNA und DARS-AS1-shRNA auf die Koloniebildung in SW620-Zellen.Zellproliferation (d), Sphäroidbildung (e) und Koloniebildung (f) von SW620-Zellen, die DARS-AS1 überexprimieren.Die gezeigten Daten sind der Mittelwert ± Standardabweichung von drei Experimenten.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 und *** p ≤ 0,001 durch den zweiseitigen Student-t-Test.
Um Funktionsverluststudien zu ergänzen, haben wir als nächstes SW620-Zellen erstellt, die DARS-AS1 überexprimieren (ergänzende Abb. 2g).Die Überexpression von DARS-AS1 erhöhte signifikant das Zellwachstum (1,8-fach), die Bildung nicht verankerter Sphäroide (1,4-fach) und die Koloniebildung (3,3-fach) in SW620-Zellen (Abb. 2d–f).Wir bestätigten dieses Ergebnis unter Verwendung einer anderen DARS-AS1-exprimierenden Zelllinie, A549.Diese verstärkte Zellproliferation aufgrund der DARS-AS1-Überexpression wurde ferner in A549-Zellen beobachtet (ergänzende Fig. 2h, i und ergänzende Tabelle 3).Zusammengenommen zeigen diese Gewinn- und Verluststudien, dass DARS-AS1 die Proliferation von Krebszellen in vitro fördert.
Um den zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen, durch den DARS-AS1 die Zellproliferation reguliert, führten wir eine RNA-Pulldown-Analyse durch, um seine potenziellen Proteinbindungspartner zu identifizieren.RT-qPCR-Ergebnisse zeigten, dass sich etwa 86,2 % von DARS-AS1 im Zytoplasma von SW620-Zellen befinden (ergänzende Abb. 3a).Das in vitro transkribierte biotinylierte DARS-AS1 oder pseudoRNA wurde dann mit SW620-Zelllysaten inkubiert, gefolgt von einer SDS-PAGE-Trennung.Die anschließende Silberfärbung zeigte, dass eine deutliche Bande (~38 kDa) in DARS-AS1-Pull-Proben signifikant angereichert war, aber nicht in Dummy-RNA- oder Bead-Proben (Abb. 3a).Diese Bande wurde durch Massenspektrometrie (MS) als ein PKR-aktivierendes Protein (PACT) identifiziert und durch Immunoblotting in SW620-, HCT116- und HepG2-Zelllinien weiter bestätigt (Abb. 3a, b).Die Anreicherung von DARS und verwandten PACT-Proteinen – PKR und TRBP – wurde ebenfalls mittels RNA-Analyse durch Western Blotting (WB) untersucht.Die Ergebnisse zeigten, dass keine direkte Wechselwirkung zwischen DARS-AS1-RNA und diesen drei Proteinen gefunden wurde (Ergänzende Abb. 3b).Die spezifische Wechselwirkung zwischen DARS-AS1 und PACT wurde weiter durch RNA-Immunpräzipitationsanalyse (RIP) bestätigt, die zeigte, dass DARS-AS1 signifikant an Anti-PACT-Antikörpern angereichert war, aber nicht an anderen Kontroll-RNAs (Abbildung 3c).Um zu bestimmen, ob DARS-AS1 in Abwesenheit anderer zellulärer Komponenten direkt mit PACT interagiert, wurde ein In-vitro-Biolayer-Interferometrie(BLI)-Assay unter Verwendung von gereinigtem PACT durchgeführt.Biotin-markiertes DARS-AS1 oder Dummy-RNA wurde auf Streptavidin (SA)-Biosensoren immobilisiert und dann in kinetischem Puffer, der 1 &mgr;M PACT enthielt, inkubiert.Bemerkenswerterweise band PACT stark an DARS-AS1 (KD-Wert ~ 26,9 nM), aber nicht, um RNA nachzuahmen (Abbildung 3d).Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse eine direkte Wechselwirkung und eine hohe Affinität zwischen DARS-AS1 und PACT.
RNA-Pull-Analyse identifizierte DARS-AS1, das mit PACT in SW620-Zellen interagiert.Oben Silberfärbung verwandter Proteine.Niedrigere Immunoblots wurden mit Anti-PACT-Antikörper durchgeführt.b RNA-Pulldown-Analyse wurde in HCT116- (oben) und HepG2- (unten) Zellen durchgeführt.Die PACT-Anreicherung wurde durch Immunoblotting nachgewiesen.cRNA-Immunpräzipitations(RIP)-Assays wurden in SW620-Zellen unter Verwendung der angegebenen Antikörper durchgeführt.d PACT-Bindungskurven an Volllängen-DARS-AS1 oder Kontroll-RNA wurden unter Verwendung von Biolayer-Interferometrie (BLI) erhalten.RNA wurde auf einem Streptavidin-Biosensor immobilisiert.1 μM PACT wurde verwendet, um die Assoziation zu messen.Der RNA-Pull-Assay wurde unter Verwendung von biotinyliertem DARS-AS1 in voller Länge oder verkürzt (oben) durchgeführt.Immunoblot, der den Empfang von PACT zeigt (unten).f Gereinigtes markiertes PACT wurde mit biotinyliertem DARS-AS1 in voller Länge oder verkürzt (wie in e) für den In-vitro-RIP-Assay inkubiert.Die extrahierte RNA wurde durch RT-qPCR verifiziert.g Die relative Affinität verschiedener RNA-Fragmente für PACT wurde unter Verwendung von Biolayer-Interferometrie erhalten.Zur Analyse wurden 100 nM RNA und 1 μM RAST verwendet.h In-vitro-RIP-Assays wurden unter Verwendung von gereinigtem intaktem oder verkürztem markiertem PACT durchgeführt.Die extrahierte RNA wurde durch RT-qPCR verifiziert.i Wachstumsrate von SW620-Zellen, die DARS-AS1, PACT oder beides überexprimieren.j Die Überexpression von DARS-AS1 in voller Länge oder verkürztem DARS-AS1 in SW620-Zellen hatte unterschiedliche Auswirkungen auf das Zellwachstum.k Apoptose wurde durch Immunoblotting mit Anti-PARP-Antikörper nachgewiesen.l Knockout von DARS-AS1 induziert Apoptose von SW620-Zellen, wie durch Durchflusszytometrie gezeigt wurde.Die gezeigten Daten sind der Mittelwert ± Standardabweichung von drei Experimenten. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, durch zweiseitigen Student-t-Test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, durch zweiseitigen Student-t-Test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 durch zweiseitigen Student-t-Test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 durch zweiseitigen Student-t-Test.
Anschließend generierten wir drei biotinylierte DARS-AS1-RNA-Fragmente durch In-vitro-Transkription, um die für die PACT-Assoziation erforderliche DARS-AS1-Region zu identifizieren (Abbildung 3e).Die Ergebnisse der RNA-Analyse zeigten, dass jedes Fragment in der Lage war, mit PACT zu interagieren, aber die 3'-terminale Region (384–768 Nukleotide mit der Bezeichnung A3) zeigte mehr als 1–384 Nukleotide mit der Bezeichnung A1) (Abb. 3e).Ähnliche Ergebnisse wurden im In-vitro-RIP-Assay unter Verwendung von rekombinantem PACT beobachtet (Abbildung 3f).In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen zeigten Experimente zur Bindung immobilisierter RNA-Fragmente an PACT unter Verwendung von BLI auch, dass PACT eine höhere Affinität für A3 (384–768 nt) (KD-Wert von ungefähr 94,6 nM) hat, während es fast keine Verbindungen zu anderen Bereichen gibt.(Abb. 3d).
Wir untersuchten auch die assoziierten Bindungsregionen in PACT.PACT enthält drei funktionelle Domänen, von denen zwei konservierte doppelsträngige RNA-Bindungsdomänen (dsRBD) und eine dritte Domäne (als D3 bezeichnet) sind, die als Aktivator von Proteininteraktionen wirkt.Um die lncRNA-Bindungskapazität jeder Domäne zu untersuchen, konstruierten wir drei Mutationen, die jede der drei Domänen entfernten, und führten einen In-vitro-RIP-Assay durch.Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Deletion der dritten Domäne (D3) von PACT seine Interaktion mit DARS-AS1 signifikant reduzierte (um das 0,11-fache im Vergleich zu intaktem PACT) im Vergleich zu den anderen beiden Mutationen (Abb. 3h), es wurde gezeigt, dass die Freisetzung von D3 interagierten mit DARS.-AC1.Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die Interaktion zwischen DARS-AS1 und PACT hauptsächlich über das 3'-Ende von DARS-AS1 und die D3-Domäne von PACT erfolgen kann.
Wir stellten fest, dass DARS-AS1 keinen Einfluss auf die PACT-Expression hatte und PACT keinen Einfluss auf DARS-AS1 hatte (ergänzende Abb. 3c).Anschließend untersuchten wir die Wirkung von PACT-Knockdown auf das Zellwachstum.Im Gegensatz zu DARS-AS1 wuchsen relative Zellen 1,5- bis 3-mal schneller, wenn PACT niedergeschlagen wurde (ergänzende Abb. 3d).Die Ergebnisse des Koloniebildungstests zeigten, dass die Zellen nach der shRNA-Behandlung mit PACT zwei- bis dreifache Kolonien bildeten (ergänzende Fig. 3e).Um zu testen, ob DARS-AS1 die Zellproliferation durch PACT reguliert, haben wir SW620-Zellen generiert, die PACT, DARS-AS1 oder beide überexprimieren.Die Überexpression von PACT zeigte eine signifikante Hemmung der Zellproliferation (Abbildung 3i).Während die DARS-AS1-Überexpression per se die Zellproliferation signifikant förderte, gab es keinen signifikanten Unterschied in der Wachstumsrate von DARS-AS1 und PACT überexprimierenden Zellen.Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PACT der erhöhten Proliferation entgegenwirken kann, die durch DARS-AS1-Überexpression verursacht wird.
Da verschiedene Regionen von DARS-AS1 unterschiedliche PACT-Bindungsfähigkeiten haben, untersuchten wir ihren relativen Einfluss auf die Zellproliferation durch unterschiedliche Überexpression von DARS-AS1-Fragmenten.Im Vergleich zu den beiden anderen Fragmenten war DARS-AS1 am 3'-Ende (384–768 nt), der wichtigsten PACT-bezogenen Region in DARS-AS1, die die höchste Fähigkeit zur Stimulierung der Zellproliferation hatte, überexprimiert (Abb. 3j).Diese Ergebnisse weisen auf eine positive Korrelation zwischen der Bindungskapazität und der biologischen Funktion von DARS-AS1 hin.
Es wurde berichtet, dass PACT ein pro-apoptotisches Protein ist19.Daher untersuchten wir die Wirkung von DARS-AS1 auf die Apoptose.Wie erwartet erhöhte der DARS-AS1-Knockdown die PARP-Spaltung in SW620-Zellen signifikant und erhöhte den Anteil an Annexin-V-positiven Zellen in SW620-, HCT116-, HepG2- und MBA-MD-231-Zelllinien (Abb. 3k).3).3f–h), was darauf hindeutet, dass die antiapoptotische Wirkung von DARS-AS1 in Krebszellen der Apoptose-induzierenden Funktion von PACT entgegengesetzt ist.Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass der Mechanismus der onkogenen Funktion von DARS-AS1 auf der Hemmung der PACT-Funktion beruhen könnte.
Als nächstes untersuchten wir die funktionalen Implikationen der DARS-AS1-PACT-Assoziation.Es wurde berichtet, dass PACT PKR durch direkte Wechselwirkung aktiviert, was anschließend die eIF2α-Phosphorylierung verstärkt und eine translationale Deletion und Apoptose verursacht17.Zunächst untersuchten wir, ob DARS-AS1 die zelluläre Lokalisierung von PACT und PKR beeinflusst.Konfokale Fluoreszenzmikroskopie zeigte, dass PACT und PKR in SW620-Zellen mit einem durchschnittlichen Pearson-Korrelationskoeffizienten von 0,72 stark kolokalisiert waren.Unterdessen reduzierte die DARS-AS1-Überexpression die Kolokalisierung von PACT und PKR signifikant (mittlerer Pearson-Korrelationskoeffizient 0,61) (Abbildung 4a).Um zu untersuchen, ob DARS-AS1 die PACT-PKR-Interaktion modulieren könnte, führten wir einen Co-Immunpräzipitationstest (Co-IP) mit Anti-PACT-Antikörper in SW620-Zelllysaten durch.PKR war in Kontrollzellen stark mit Anti-PACT angereichert, während die PKR-Erholung in Lysaten von Zellen, die DARS-AS1 überexprimierten, signifikant reduziert war ( 4b ).Gereinigtes markiertes PACT und PKR wurden für in vitro-Proteinbindungsassays verwendet.Dementsprechend zeigten diejenigen, die DARS-AS1, aber keine Kontroll-RNA lieferten, eine unterdrückte PACT-PKR-Interaktion (Abbildung 4c).Alle Ergebnisse zeigten, dass DARS-AS1 die PACT- und PKR-Kommunikation störte.
a Co-Lokalisierung von PACT und PKR in Kontrollzellen oder Zellen, die DARS-AS1 überexprimieren, wurde mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie beobachtet.Die Kerne wurden mit DAPI gefärbt.Statistische Ergebnisse wurden von 16 Fotografien erhalten.b Co-Immunpräzipitation (co-IP) unter Verwendung von Anti-PACT-Antikörper in Zelllysaten von Kontroll-SW620-Zellen oder Zellen, die DARS-AS1 überexprimieren.c Markiertes PACT, gereinigtes PKR und in vitro transkribiert mit DARS-AS1 oder Mock-RNA wurden für die in vitro-Proteinbindungsanalyse inkubiert.Anti-Flag-Antikörper wurden für die Immunpräzipitation verwendet.d Immunoblots mit den angegebenen Antikörpern wurden in SW620- und HCT116-Zellen durchgeführt, die mit Kontroll-shRNA oder DARS-AS1-shRNA transfiziert waren, gefolgt von Serumentzug.e DARS-AS1-Expressionsniveaus veränderten die zelluläre Empfindlichkeit gegenüber Thapsigargin.SW620-Zellen wurden mit DARS-AS1-shRNA, DARS-AS1-Überexpressionsplasmid oder Kontrollplasmid transfiziert.Die Zellen wurden 48 Stunden lang mit Thapsigargin behandelt und die Zelllebensfähigkeit wurde unter Verwendung des MTS-Reagenz bestimmt.f In vitro transkribiertes DARS-AS1 oder Dummy-RNA und gereinigtes PACT wurden für den In-vitro-Aktivierungsassay und den Immunoblot-Nachweis verwendet.g Immunoblots unter Verwendung dieser Antikörper wurden an SW620-ctrl-Zellen (links) oder Zellen, die PKR-Mutanten überexprimieren (rechts), durchgeführt.Diese Zellen wurden dann mit Kontroll-shRNA oder DARS-AS1-shRNA transfiziert, gefolgt von Serummangel.h Durchflusszytometrie zeigte, dass die Inaktivierung der mutierten PKR die DARS-AS1-induzierte Apoptose in SW620-Zellen kompensierte.i Immunoblots mit den angegebenen Antikörpern wurden in SW620- (links) oder HCT116- (rechts) Zellen durchgeführt.Zellen, die mit Kontroll-shRNA oder DARS-AS1-shRNA transfiziert sind, werden Serum entzogen und mit 100 nM PKR C16-Inhibitor oder DMSO ergänzt.Maßstabsleiste = 5 µm.Die gezeigten Daten sind der Mittelwert ± Standardabweichung von drei Experimenten.* p ≤ 0,05 zweiseitiger Student-t-Test.
Es wird allgemein angenommen, dass PKR-Phosphorylierung bei Thr451 induziert werden kann, sobald PACT mit PKR17 interagiert.Unsere Ergebnisse zeigten, dass das Niveau der PKR-Phosphorylierung in DARS-AS1-Knockdown-Zellen nach Serummangel signifikant erhöht war (Abb. 4d und ergänzende Abb. 4a).Dementsprechend stellten wir fest, dass die Phosphorylierung von eIF2α, dem Hauptsubstrat der PKR, auch durch DARS-AS1-shRNA signifikant erhöht wurde (Abb. 4d und ergänzende Abb. 4a).Thapsigargin ist ein ER-Stressor, der bewirkt, dass das ER Ca2+ freisetzt.Es wurde berichtet, dass die Behandlung mit Thapsigargin die Expression und Aktivierung von PACT induziert, das weiter mit PKR interagiert und es aktiviert, was durch Erhöhung der eIF2α-Phosphorylierung zu Apoptose führt 18,61 .Hier verwendeten wir Thapsigargin als Stimulator des PACT/PKR-Signalwegs, um zu untersuchen, ob DARS-AS1 den Zellen helfen kann, Stress zu überwinden, indem es den PACT/PKR-Signalweg hemmt.Wir beobachteten, dass das Ausmaß der DARS-AS1-Expression positiv mit der Zellresistenz gegenüber Thapsigargin korrelierte.SW620-Zellen, die DARS-AS1 überexprimieren, überlebten besser, wenn sie mit Thapsigargin behandelt wurden, während Zellen mit DARS-AS1-Knockdown anfälliger wurden (Abb. 4e).In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen reduzierte die DARS-AS1-Überexpression die Thapsigargin-induzierte PKR-Phosphorylierung (ergänzende Abb. 4b).Im Gegensatz dazu wurden nach der Behandlung mit Thapsigargin PKR und eIF2α in DARS-AS1-Knockdown-Zellen in höherem Maße phosphoryliert als in Kontrollzellen (ergänzende Abb. 4b).Interessanterweise induzierte Thapsigargin die DARS-AS1-Expression dosisabhängig, was auf eine Anti-Stress-Funktion von DARS-AS1 hindeuten könnte (ergänzende Abb. 4c).Zusätzlich führten wir In-vitro-Aktivierungsassays durch, um diese Beobachtungen zu bestätigen.Kurz gesagt wurde PKR aus Zelllysaten unter Verwendung eines Anti-PKR-Antikörpers gereinigt, dann mit rekombinantem PACT und in vitro transkribiertem DARS-AS1 inkubiert.Nach der enzymatischen Reaktion wurde Phospho-PKR mittels WB nachgewiesen.Unsere Ergebnisse zeigten, dass die PKR-Phosphorylierung durch DARS-AS1 signifikant gehemmt wurde, aber nicht durch Kontroll-RNA (Abbildung 4f).Diese In-vitro- und In-vivo-Ergebnisse legen nahe, dass DARS-AS1 die PACT-vermittelte PKR-Aktivierung hemmt.Gleichzeitig beobachteten wir auch eine Abnahme der PACT-Erholung in Gegenwart von DARS-AS1 (Abbildung 4f).Dieses Ergebnis stimmt mit den Ergebnissen des In-vitro-Proteinbindungsassays ( 4c ) überein und veranschaulicht erneut die Blockierungsfunktion von DARS-AS1 für die PACT-PKR-Assoziation.
Ser246 und Ser287 in der D3-Domäne von PACT sind für die PKR-Aktivierung unter zellulärem Stress erforderlich.Die Substitution von Alanin durch zwei Serinreste ergab mutantes PACT (mutD), die PKR in Abwesenheit von Stress aktivierte, und die Substitution von Alanin (mutA) kehrte das Protokoll um.Da wir die Bedeutung dieser Domäne in direkter Assoziation mit DARS-AS1 gezeigt haben, haben wir diese beiden PACT-Mutanten erzeugt, um zu testen, ob diese Reste auch an der Interaktion mit DARS-AS1 beteiligt sein könnten.Interessanterweise verloren beide Mutanten die Fähigkeit, an DARS-AS1 zu binden (ergänzende Abb. 4d), was darauf hindeutet, dass die vollständige Struktur des PACT-Proteins für eine effiziente Interaktion mit DARS-AS1 erforderlich sein könnte.
Darüber hinaus legen unsere Ergebnisse auch nahe, dass die DARS-AS1-shRNA-induzierte Hemmung der Zellproliferation teilweise wiederhergestellt werden kann, indem eine dominant negative PACT-Mutante (PACTmutA) oder eine dominant negative PKR-Mutante (PKRmut) überexprimiert wird (ergänzende Abb. 4e. e).Die Überexpression von dominant-negativen PKR-Mutanten reduzierte die durch DARS-AS1-Knockdown induzierte PKR-Phosphorylierung sowie die eIF2α-Phosphorylierung in serumarmen Zellen (Abb. 4g).Noch wichtiger ist, dass der Anteil der durch DARS-AS1-Knockdown induzierten apoptotischen Zellen auch in Zellen reduziert wurde, die PKRmut überexprimieren (Abb. 4h und ergänzende Abb. 4g).Die Hemmung der PKR-Kinaseaktivität beeinträchtigt auch die Funktion von DARS-AS1, da die Ergebnisse zeigten, dass der Knockdown von DARS-AS1 selten eine PKR- und eIF2α-Phosphorylierung auslöste, wenn Zellen mit einem PKR-spezifischen C16-Inhibitor behandelt wurden (Abb. 4i und ergänzende Abb. 4h).).Zusammengenommen legen unsere Ergebnisse nahe, dass DARS-AS1 die Zellproliferation zumindest teilweise fördert, indem es die PACT-vermittelte PKR-Aktivierung hemmt.
Um die Rolle von DARS-AS1 bei der Tumorentstehung weiter zu untersuchen, führten wir In-vivo-Experimente unter Verwendung eines Maus-Xenograft-Modells durch. Die Ergebnisse zeigen, dass der Knockdown von DARS-AS1 das Tumorwachstum bei Mäusen dramatisch verringerte (p-Wert < 0,0001) (Abb. 5a). Die Ergebnisse zeigen, dass der Knockdown von DARS-AS1 das Tumorwachstum bei Mäusen dramatisch verringerte (p-Wert < 0,0001) (Abb. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (Ris. 5a). Die Ergebnisse zeigen, dass der Knockdown von DARS-AS1 das Tumorwachstum bei Mäusen drastisch reduziert (p-Wert < 0,0001) (Abbildung 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис. 5a). Die Ergebnisse zeigten, dass der DARS-AS1-Knockdown das Tumorwachstum bei Mäusen signifikant reduzierte (p-Wert < 0,0001) (Abbildung 5a).Somit gab es in der DARS-AS1-Knockdown-Gruppe eine signifikante Abnahme des mittleren Tumorvolumens um etwa 72,9 % und der mittleren Tumormasse um etwa 87,8 % (Abbildung 5b-d).Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass DARS-AS1 das Tumorwachstum in vivo signifikant fördern kann.
Wirkungen von AD-DARS-AS1-Knockdown auf die kolorektale Onkogenese bei Nacktmäusen.Wachstumskurven (a), Tumorgröße (b), Gewicht (c) und Tumorbilder (d) werden gezeigt.Fehlerbalken stellen ±SEM dar. n = 10. ****p < 0,0001, durch zweiseitigen Student-t-Test. n = 10. ****p < 0,0001, durch zweiseitigen Student-t-Test. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 zweiseitiger Student-t-Test.n = 10. ****p < 0,0001 ****p < 0,0001 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 zweiseitiger Student-t-Test.e Kaplan-Meier analysierte die Korrelation zwischen DARS-AS1-Expressionsniveaus und dem Gesamtüberleben bei Patienten mit UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM und LGG.Hohe DARS-AS1-Expressionsniveaus bei Patienten waren in den oberen 50 %;das niedrige Niveau der DARS-AS1-Expression bei den Patienten lag bei den unteren 50 %.p-Werte wurden mit dem Log-Rank-Test bestimmt.f Vorgeschlagenes Modell, in dem DARS-AS1 den PACT-PKR-Weg und das Tumorwachstum reguliert.
Um die klinischen Auswirkungen von DARS-AS1 besser zu verstehen, untersuchten wir die Korrelation zwischen seiner Expression und dem Überleben der Patienten.Durch die Analyse des TCGA-Datensatzes stellten wir fest, dass eine höhere DARS-AS1-Expression mit Aderhautmelanom (UVM), renaler Chromophobie (KICH), papillärem Nierenzellkarzinom (KIRP), Mesotheliom (MESO) und Multiplex assoziiert war.Ein geringeres Überleben war signifikant mit Glioblastommorphose (GBM) und Patienten mit niedriggradigem Hirngliom (LGG) verbunden (Abbildung 5e).Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass DARS-AS1 eine wichtige Rolle bei der klinischen Tumorprogression spielen und ein potenzieller prädiktiver Biomarker bei mehreren Krebsarten sein könnte.
In dieser Studie haben wir mithilfe eines groß angelegten funktionellen CRISPRi-Screenings festgestellt, dass die DARS-AS1-lncRNA den Stress von Krebszellen überwindet, indem sie zwei wichtige Stressantworten, PACT und PKR, reguliert.Durch die direkte Wechselwirkung mit PACT hemmte DARS-AS1 die PACT-vermittelte PKR-Aktivierung, wodurch der apoptotische Zelltod verhindert und die Zellproliferation gefördert wurde (Abb. 5f).Eine Hochregulierung von DARS-AS1 wurde bei mehreren Krebsarten beobachtet, was darauf hindeutet, dass seine Funktion, das Überleben von Krebszellen unter Stressbedingungen zu fördern, auf mehrere Krebsarten allgemein anwendbar sein könnte.
PACT wurde als PKR-Aktivatorprotein identifiziert, und die PACT-vermittelte PKR-Aktivierung spielt eine wichtige Rolle bei Stressreaktionen, indem sie Transkription, Translation, Apoptose und andere wichtige zelluläre Prozesse reguliert62.Seit Jahrzehnten wird versucht, die krebsspezifische Regulation der PACT-PKR-Kaskade zu verstehen.Hier zeigte unsere Studie einen anderen Regulationsmechanismus von PACT-PKR in Krebszellen durch zelluläre lncRNA DARS-AS1, die direkt an PACT bindet, die PACT-PKR-Interaktion blockiert, die PKR-Aktivierung und eIF2α-Phosphorylierung hemmt und dadurch die stressinduzierte Apoptose hemmt und Stimulieren der eventuellen Krebsproliferation.Zellen.Diese Entdeckung wirft Licht auf potenzielle lncRNA-Targets für die Krebsprognose und -therapie.
Unsere Daten zeigten, dass der DARS-AS1-Knockdown Zellen für Serummangel sensibilisiert, mit einem signifikanten Anstieg von phosphoryliertem PKR und eIF2α.Diese Ergebnisse legen nahe, dass DARS-AS1 das Überleben von Krebszellen unter harten Bedingungen fördert, indem es die PACT/PKR-Aktivität hemmt.Mehrere andere nichtkodierende RNAs, wie ASPACT und nc886, sind ebenfalls an der PACT/PKR-Achse beteiligt, indem sie die PACT48-mRNA herunterregulieren oder die Autophosphorylierung durch Bindung an PKR49,50,64 regulieren.Unter ihnen fungiert DARS-AS1 als Disruptor der PACT-PKR-Assoziation.Diese Studie bereichert unser Verständnis der PACT/PKR-Achsenregulation und der Rolle von lncRNAs bei Stressreaktionen.
PACT enthält drei separate Domänen.Jede der ersten beiden dsRBDs reicht aus, um eine hochaffine Bindung von PACT an PKR zu erreichen, während die dritte Domäne (D3) für die PKR-Aktivierung in vitro und in vivo erforderlich ist.Unsere Studie zeigte, dass DARS-AS1 bevorzugt mit der D3-Domäne interagiert (Abb. 3h).Angesichts der großen Größe der lncRNA (768 Nukleotide) kann die Bindung von DARS-AS1 an D3 die Wechselwirkung zwischen der PACT-Domäne von dsRBD und PKR physikalisch hemmen, wodurch die Assoziation von PACT und PKR blockiert wird.PACT-Punktmutationen, die Ser246 und Ser287 in D3 durch Alanin oder Aspartat ersetzten, störten seine Bindungsaffinität für DARS-AS1, was auf die Bedeutung der gesamten strukturellen und elektrischen Eigenschaften von D3 in ihrer Assoziation hinweist.Weitere Einzelheiten dieses Mechanismus werden in Zukunft erforderlich sein, wobei eine genauere biochemische Analyse und eine hochauflösende PACT-Strukturanalyse verwendet werden.
Frühere Studien haben berichtet, dass DARS-AS1 die Zellproliferation durch mehrere Mechanismen fördert51,52,53.In einem Beispiel beobachteten die Forscher, dass DARS-AS1 sein für das Antisense-Protein kodierendes DARS-Gen hochregulierte, indem es auf miP-194-5p in Nierenkrebszellen abzielte.In der vorliegenden Studie hatte der DARS-AS1-Knockdown jedoch nur geringe Auswirkungen auf die DARS-Transkription bei mehreren Krebsarten, darunter zumindest Darm-, Brust- und Leberkrebs.Da lncRNAs zell- und gewebespezifische Expressionsmuster aufweisen, sind funktionelle Mechanismen möglicherweise nicht über Krebsarten hinweg konserviert, was zu dieser Diskrepanz zwischen unseren Beobachtungen und früheren Bewertungen verschiedener Krebsarten beitragen kann.Spezielle Studien sind erforderlich, um die spezifischen Mechanismen verschiedener physiologischer und pathologischer Prozesse aufzuklären.
Eine Analyse klinischer Daten zeigte, dass die DARS-AS1-Expression in Tumoren umgekehrt mit dem Überleben von Krebspatienten korreliert, was die Bedeutung der DARS-AS1/PACT/PKR-Achse für die Krebsprognose unterstreicht.Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass DARS-AS1 ein Regulator der PACT/PKR-Signalachse ist, die Proliferation von Krebszellen fördert und die Apoptose während der Stressreaktion hemmt, was eine weitere Forschungsrichtung darstellt und für die zukünftige Erforschung potenzieller Behandlungen von Interesse ist .
Die menschlichen Zelllinien SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 und HEK293T wurden von der National Cell Line Resource Infrastructure in China bezogen.Alle Zellen wurden in DMEM-Medium (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), ergänzt mit 10 % FBS (Gemini, Brooklyn, NY) und 1 % Penicillin-Streptomycin (Thermo Fisher Scientific) bei 37 °C, 5 % CO2 gehalten.Inkubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (Phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));Anti-eIF2α (Phosphor S51), Abcam (ab32157);Anti-PACT (Phosphor S246), Abgent (AP7744b);Anti-β-Tubulin, CST (2128);normales Maus-IgG, CST (5415S);normales Kaninchen-IgG, CST (2729S).Antikörper wurden 1:1000 in PBST für Western Blotting und 1:100 für IP verdünnt.
sgRNAs wurden mit einem öffentlich verfügbaren Tool namens CRISPR-ERA66 entwickelt.Wir verwendeten die Standardwerkzeugparameter für die sgRNA-Entwicklung und den Algorithmus berechnete sgRNA-Bindungsstellen in der 3-kb-Region.zentriert auf TSS.Pools von sgRNA-Oligonukleotiden wurden bei CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) synthetisiert und in humanisierte pgRNA-Plasmide (Addgene #44248) kloniert.Insgesamt 12 µg gepooltes humanisiertes pgRNA-Plasmid, 7,2 µg psPAX2 (Addgene #12260) und 4,8 µg pMD2.G (Addgene #12259) wurden in 5 x 106 HEK293T in 10-cm-Schalen unter Verwendung von DNAfect Transfection Reagent co-transfiziert Zellen (CWBIO, Beijing, China) nach Herstellerangaben.Virushaltige Überstände wurden 48 und 72 Stunden nach der Transfektion gesammelt und durch einen 0,45-&mgr;m-Filter filtriert.Für das Screening wurden SW620-Zellen, die das dCas9/KRAB-Fusionsprotein exprimieren, durch Virustransduktion erhalten.Modifizierte SW620-Zellen wurden mit der Virusbibliothek in vier unabhängigen Infektionsexperimenten bei einer MOI von 0,1–0,3 infiziert und ihnen wurden 2 Tage lang Proben mit 2 &mgr;g/ml Puromycin (Sigma, St. Louis, MO) entnommen.Danach wurden die Zellen für 18 Tage in vitro mit einer minimalen Bibliotheksabdeckung von 500 Zellen/sgRNA für das Screening kultiviert.
Genomische DNA wurde gemäß den Anweisungen des QIAamp DNA Blood Midi Kits (QIAGEN, Düsseldorf, Deutschland; 51183) extrahiert.Insgesamt wurden 100 μg genomische DNA pro biologischer Wiederholung verwendet, um die Bibliothek aufzubauen.Die sgRNA-Region wurde durch zwei PCR-Runden amplifiziert und mit einem Barcode verknüpft.
PCR-Produkte wurden unter Verwendung des NucleoSpin®-Gels und des PCR-Reinigungskits (MACHEREY-NAGEL, Düren, Deutschland; 740609.250) gereinigt und unter Verwendung des Qubit™ HS-Doppelstrang-DNA-Nachweiskits (Thermo Fisher Scientific; Q32854) quantifiziert.
Der MTS-Assay wurde verwendet, um die Zellproliferation zu messen.Die Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen mit einer anfänglichen Dichte von 2000 Zellen/Vertiefung ausgesät.Die relative Zellzahl wurde täglich zur angegebenen Zeit für insgesamt 4–6 Tage gemessen.Für jede Vertiefung wurden 20 &mgr;l MTS-Reagenz (Promega) mit 100 &mgr;l DMEM verdünnt, mit Zellen für 4 h bei 37°C inkubiert und dann OD490 gemessen.
Die Fähigkeit zum unverankerten Wachstum wurde durch die Analyse der Bildung von Kugeln entdeckt.Kurz gesagt wurden 2000 mit shRNA DARS-AS1 oder Kontroll-shRNA transfizierte Zellen in Mikroplatten mit ultraniedriger Anheftung (Corning) kultiviert, wobei das Medium alle 4 Tage gewechselt wurde.Die Sphäroide wurden nach 14 Tagen gezählt.500 mit dem DARS-AS1-Überexpressionsplasmid oder einem Kontrollplasmid transfizierte Zellen wurden für den Verstärkungsassay verwendet, ansonsten war das Verfahren unverändert.
RNA wurde unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase und Biotin-16-UTP (Roche 1138908910) gemäß den Anweisungen von Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440) transkribiert.Die hier verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 4 aufgeführt.
Proteinkodierende PACT- oder PKR-Regionen wurden in pET15b (Addgene #73619) kloniert und in BL21(DE3) transformiert.Die Bakterien wurden über Nacht in mit Ampicillin versorgtem LB inkubiert und dann 100-fach mit frischem LB verdünnt.Als die OD600 des Mediums 0,8 erreichte, wurde 1 mM IPTG hinzugefügt, um die Proteinexpression zu induzieren.Nach Inkubation über Nacht unter leichtem Schütteln (250 U/min bei 20°C) wurde das Zellpellet durch Zentrifugation (4000 U/min, 10 min, 4°C) gesammelt.Das Zellpellet in Lysepuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) resuspendieren und 30 min auf Eis inkubieren, dann beschallen (15 min, 5 s an/aus, auf Eis) und zentrifugieren (13.000 U/min)., 30 min, 4°С).Der Überstand wurde dann dreimal bei 4°C auf Ni-NTA-Harz (QIAGEN) geladen, viermal mit Waschpuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM Imidazol, 250 mM NaCl) gewaschen und insgesamt dreimal eluiert 10 ml Laufmittelpuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM Imidazol).Gereinigtes Protein wurde unter Verwendung von WB bestimmt und die Konzentration wurde unter Verwendung des Qubit TM Protein-Assay-Kits (Thermo Fisher Scientific; Q 33212) bestimmt.
RIP-Assays wurden wie zuvor beschrieben mit Modifikationen durchgeführt.Kurz gesagt, 1x RIP-Puffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 % NP-40, RNasin-Ribonuklease-Inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, Protease) lysiert zytostatischen 1 x 107-Cocktail (Roche, 1 mM DTT) und bei 13.000 U/min für 15 min bei 4 °C zentrifugieren.Der Überstand wurde dann mit Protein-A+G-Magnetkügelchen (Millipore), die mit 5 &mgr;g Anti-PACT-Antikörper (Abeam) oder IgG (CST) konjugiert waren, inkubiert.Die Kügelchen wurden fünfmal mit 5x RIP-Puffer gewaschen, dann mit Proteinase K (NEB) verdaut.RNA wurde mit Trizol extrahiert und durch RT-qPCR bestimmt.Primer sind in der Ergänzungstabelle 5 dargestellt.
Der In-vitro-RIP-Assay wurde gemäß einem modifizierten Standard-RIP-Assay-Protokoll durchgeführt.Insgesamt 5 pmol in vitro transkribierte RNA wurden 1x mit RIP-Puffer verdünnt und durch Inkubation bei 65°C für 5 Minuten hybridisiert, gefolgt von langsamem Abkühlen auf Raumtemperatur.Insgesamt 5 pmol intakter oder mutierter Flag-markierter PACT-Proteine ​​wurden aus E. coli gereinigt.Inkubieren Sie mit renaturierter RNA für 2 Stunden bei 4 °C und befolgen Sie das obige Verfahren zur RIP-Analyse für Anti-Flag-IP.
Für die RNA-Verlängerungsanalyse wurden 1 × 10 7 Zellen mit 1 × RIP-Puffer lysiert.Nach 15-minütiger Zentrifugation bei 13.000 U/min bei 4°C wurde der Überstand mit 30 μl Streptavidin Magnetic Beads (Beckman) für 2 h bei 4°C vorbehandelt.Das gereinigte Lysat wurde dann mit Hefe-tRNA versehen und mit 40 pmol renaturierter RNA über Nacht bei 4°C, dann für weitere 2 Stunden inkubiert und 20 μl neue BSA-blockierte Streptavidin-Magnetbeads wurden hinzugefügt.Der Waschschritt bestand aus 4 Mal mit 5x RIP-Puffer und 4 Mal mit 1x RIP-Puffer.Die entsprechenden Proteine ​​wurden mit Biotin-Elutionspuffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-Biotin, PMSF) eluiert und auf NuPAGE 4-12 % Bis-Tris-Gel (Invitrogen) aufgetrennt.Nach Silberfärbung (Beyotime Biotechnology) wurden bestimmte Banden ausgeschnitten und durch MS analysiert.
Es wurde eine Co-IP-Analyse durchgeführt, um die Wechselwirkung zwischen PACT und PKR zu testen.Kurz gesagt wurden überstehende Lysate durch Inkubieren von 1 × 10 7 lysierten Zellen in 1 × RIP-Puffer, gefolgt von Zentrifugation bei 13.000 U/min für 15 Minuten bei 4°C, hergestellt.Lysate wurden mit Protein A + G-Magnetkügelchen beladen, mit 5 &mgr;g Anti-PACT-Antikörper konjugiert und über Nacht bei 4°C vorsichtig rotiert.Die Kügelchen wurden dreimal mit 5 x RIP-Puffer, zweimal mit 1 x RIP-Puffer gewaschen und mit 1 x SDS-Puffer eluiert.Das gewonnene Protein wurde durch SDS-PAGE-Gel analysiert und durch WB nachgewiesen.
Zwei pmol markiertes PACT und 1 pmol PKR wurden aus E. coli gereinigt.In 1 × RIP-Puffer verdünnen und mit 10 pmol renaturierter RNA für 2 Stunden bei 4 °C inkubieren.Danach wurden sie für weitere zwei Stunden mit Protein-A+G-Magnetkügelchen-konjugiertem anti-markiertem Antikörper inkubiert.Die Kügelchen wurden dann viermal mit 1 x RIP-Puffer gewaschen und mit 1 x SDS-Puffer eluiert.Das resultierende PACT und PKR wurden durch WB nachgewiesen.