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Enzymatische Proximity-Marking-Methoden auf Basis von aktivierten Estern oder Phenoxyradikalen werden häufig verwendet, um subzelluläre Proteome und Protein-Interaktoren in lebenden Zellen zu kartieren.Aktivierte Ester sind jedoch weniger reaktiv, was zu einem großen Markierungsradius führt, und durch Peroxidbehandlung erzeugte Phenoxyradikale können Redoxwege stören.Hier berichten wir über eine Proximity-Labeling-abhängige Photoaktivierungsmethode (PDPL), die durch genetische Verknüpfung des miniSOG-Photosensibilisatorproteins mit einem interessierenden Protein entwickelt wurde.Durch blaues Licht getriggert und durch Belichtungszeit gesteuert, wird Singulett-Sauerstoff erzeugt und anschließend eine orts- und zeitaufgelöste Markierung von Histidinresten durch die Anilinsonde erreicht.Wir demonstrieren seine hohe Wiedergabetreue durch Organellen-spezifisches Proteom-Mapping.Ein direkter Vergleich von PDPL mit TurboID zeigt eine spezifischere und umfassendere proteomische Abdeckung von PDPL.Als nächstes wendeten wir PDPL auf den krankheitsassoziierten transkriptionellen Koaktivator BRD4 und die E3-Parkin-Ligase an und fanden bisher unbekannte Interaktoren.Durch Überexpressionsscreening wurden zwei unbekannte Substrate, Ssu72 und SNW1, für Parkin identifiziert, dessen Abbau durch den Ubiquitinations-Proteasom-Weg vermittelt wird.
Die genaue Charakterisierung von Proteinnetzwerken liegt vielen grundlegenden zellulären Prozessen zugrunde.Daher wird eine hochgenaue räumlich-zeitliche Kartierung von Proteinwechselwirkungen eine molekulare Grundlage für die Entschlüsselung biologischer Wege und Krankheitspathologien und die Unterbrechung dieser Wechselwirkungen für therapeutische Zwecke liefern.Zu diesem Zweck sind Verfahren, die in der Lage sind, zeitliche Wechselwirkungen in lebenden Zellen oder Geweben nachzuweisen, sehr wünschenswert.Die Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (AP-MS) wurde in der Vergangenheit verwendet, um Bindungspartner von interessierenden Proteinen (POIs) zu identifizieren.Mit der Entwicklung quantitativer Proteomics-Methoden entstand Bioplex3.0, die größte Datenbank von Proteinnetzwerken auf Basis von AP-MS.Obwohl AP-MS sehr leistungsfähig ist, sind die Zelllyse- und Verdünnungsschritte im Arbeitsablauf auf schwache und vorübergehende Bindungswechselwirkungen ausgerichtet und führen Post-Lyse-Artefakte wie falsche Wechselwirkungspaare ein, denen vor der Lyse eine Kompartimentierung fehlt.
Um diese Probleme anzugehen, wurden unnatürliche Aminosäuren (UAA) mit Vernetzungsgruppen und enzymatische Near-Labeling-Plattformen (PL) (z. B. APEX und BioID)5 entwickelt.Obwohl die UAA-Methode in vielen Szenarien erfolgreich angewendet wurde und Informationen zu direkten Proteinklebstoffen liefert, ist eine Optimierung der UAA-Insertionsstelle noch erforderlich.Noch wichtiger ist, dass es sich um ein stöchiometrisches Markierungsverfahren handelt, dem eine katalytische Umkehrung von Markierungsereignissen fehlt.Im Gegensatz dazu fusionieren enzymatische PL-Methoden wie die BioID-Methode die konstruierte Biotin-Ligase mit POI7, das anschließend Biotin aktiviert, um ein reaktives Biotinyl-AMP-Ester-Zwischenprodukt zu bilden.Das Enzym katalysiert und setzt somit eine aktivierte Biotin-„Wolke“ frei, die proximale Lysinreste markiert.BioID benötigt jedoch mehr als 12 Stunden, um ein ausreichend markiertes Signal zu erhalten, was eine Verwendung mit zeitlicher Auflösung ausschließt.Mithilfe der gerichteten Evolution auf der Grundlage von Hefe-Display wurde TurboID auf der Grundlage von BioID entwickelt, um effizienter zu sein und eine effiziente Markierung mit Biotin innerhalb von 10 Minuten zu ermöglichen, wodurch dynamischere Prozesse untersucht werden können.Da TurboID hochaktiv ist und die endogenen Biotinspiegel für eine geringe Markierung ausreichen, wird die Hintergrundmarkierung zu einem potenziellen Problem, wenn eine stark verbesserte und zeitgesteuerte Markierung durch die Zugabe von exogenem Biotin erforderlich ist.Darüber hinaus sind aktivierte Ester wenig reaktiv (t1/2 ~5 min), was zu einem großen Markierungsradius führen kann, insbesondere nach Sättigung benachbarter Proteine ​​mit Biotin 5. Phenolradikale und ermöglicht die Proteinmarkierung innerhalb einer Minute.9, 10. APEX wird häufig verwendet, um subzelluläre Proteome, Membranproteinkomplexe und zytosolische Signalproteinkomplexe zu identifizieren.11, 12. Die Notwendigkeit hoher Peroxidkonzentrationen kann jedoch Redoxproteine ​​oder -wege beeinträchtigen und stören zelluläre Prozesse.
Daher wird eine neue Methode, die in der Lage ist, reaktivere Spezies zur Unterdrückung des markierten Radius mit hoher räumlicher und zeitlicher Genauigkeit zu erzeugen, ohne die Zellwege signifikant zu stören, eine wichtige Ergänzung zu bestehenden Methoden sein. Unter den reaktiven Spezies erregte Singulett-Sauerstoff unsere Aufmerksamkeit aufgrund seiner kurzen Lebensdauer und seines begrenzten Diffusionsradius (t1/2 < 0,6 µs in Zellen)13. Unter den reaktiven Spezies erregte Singulett-Sauerstoff unsere Aufmerksamkeit aufgrund seiner kurzen Lebensdauer und seines begrenzten Diffusionsradius (t1/2 < 0,6 µs in Zellen)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Unter den aktiven Formen erregte Singulett-Sauerstoff unsere Aufmerksamkeit aufgrund seiner kurzen Lebensdauer und seines begrenzten Diffusionsradius (t1/2 < 0,6 µs in Zellen)13.< 0,6 µs < 0,6 µs < 0,6 µs 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Unter den aktiven Formen zieht Singulett-Sauerstoff unsere Aufmerksamkeit wegen seiner kurzen Lebensdauer und seines begrenzten Diffusionsradius (t1/2 < 0,6 μs in Zellen) auf sich.Es wurde berichtet, dass Singulett-Sauerstoff zufällig Methionin, Tyrosin, Histidin und Tryptophan oxidiert, wodurch es polar 14,15 für die Bindung an Amin- oder Thiol-basierte Sonden wird16,17.Obwohl Singulett-Sauerstoff verwendet wurde, um RNA des subzellulären Kompartiments zu markieren, bleiben Strategien zur Wiederverwendung von endogenen POI-Näherungsmarkern unerforscht.Hier stellen wir eine Plattform namens Photoaktivierungsabhängige Näherungsmarkierung (PDPL) vor, bei der wir blaues Licht verwenden, um mit einem miniSOG-Photosensibilisator fusionierte POIs zu beleuchten und die Erzeugung von Singulett-Sauerstoff auszulösen, um proximale Reste zu oxidieren, gefolgt von aminhaltigen Modifikationen, um chemische Sonden zu oxidieren Zwischenlebende Zellen..Wir haben eine Gruppe chemischer Sonden getestet, um die Tag-Spezifität zu maximieren, und mithilfe eines offenen Proteomik-Workflows Modifikationsstellen identifiziert.Ein direkter Vergleich von PDPL mit TurboID zeigt eine spezifischere und umfassendere proteomische Abdeckung von PDPL.Wir wendeten diesen Ansatz auf organellenspezifische Marker des subzellulären Proteoms und die allgemeine Proteomidentifizierung von Bindungspartnern für das krebsassoziierte epigenetische regulatorische Protein BRD4 und die Parkinson-assoziierte E3-Ligase Parkin an, die sowohl ein bekanntes als auch ein unbekanntes Proteinnetzwerk bestätigte Interaktionen..Die Fähigkeit von PDPL, E3-Substrate in großen Proteinkomplexen zu erkennen, stellt eine Situation dar, in der die Erkennung indirekter Binder erforderlich ist.Zwei unbekannte, durch Ubiquitinations-Proteasom vermittelte Parkin-Substrate wurden in situ bestätigt.
Photodynamische Therapie (PDT)19 und Chromophor-unterstützte Laserinaktivierung (CALI)20, bei der Lichtbestrahlung mit Photosensibilisatoren Singulett-Sauerstoff erzeugt, können Zielproteine ​​inaktivieren oder Zelltod verursachen.Da Singulett-Sauerstoff eine hochreaktive Substanz mit einer theoretischen Diffusionsdistanz von etwa 70 nm ist, kann eine räumlich begrenzte Oxidation um den Photosensibilisator kontrolliert werden.Basierend auf diesem Konzept haben wir uns entschieden, Singulett-Sauerstoff zu verwenden, um eine genaue Markierung von Proteinkomplexen in lebenden Zellen zu erreichen.Wir haben einen chemoproteomischen PDPL-Ansatz entwickelt, um vier Funktionen zu erfüllen: (1) die Erzeugung von aktivem Singulett-Sauerstoff ähnlich dem enzymatischen PL-Ansatz zu katalysieren;(2) Bereitstellung einer zeitaufgelösten Markierung bei Lichtinitiation;(3) durch Veränderung (4) Vermeiden Sie die Verwendung von endogenen Cofaktoren (wie Biotin), um den Hintergrund zu reduzieren, oder verwenden Sie stark störende exogene Reagenzien (wie Peroxide), um die Zellexposition gegenüber Umweltstress zu minimieren.
Photosensibilisatoren können in zwei Kategorien eingeteilt werden, darunter Fluorophore mit kleinem Molekulargewicht (z. B. Bengalrosa, Methylenblau)22 und genetisch codierte kleine Proteine ​​(z. B. miniSOG, KillerRed)23.Um ein modulares Design zu erreichen, haben wir die PDPL-Plattform der ersten Generation entwickelt, indem wir Photosensibilisator (PS)-Proteine ​​zu POI hinzugefügt haben24,25 (Abbildung 1a).Bei Bestrahlung mit blauem Licht oxidiert Singulett-Sauerstoff proximale nukleophile Aminosäurereste, was zu einer Umpolungspolarität führt, die elektrophil ist und weiter mit Aminsonden-Nukleophilen reagieren kann16,17.Die Sonde ist mit einem Alkin-Griff ausgestattet, um Click-Chemie und Herunterziehen für die LC/MS/MS-Charakterisierung zu ermöglichen.
Schematische Darstellung der durch miniSOG vermittelten Markierung von Proteinkomplexen.Wenn sie blauem Licht ausgesetzt werden, erzeugen Zellen, die miniSOG-POI exprimieren, Singulett-Sauerstoff, der interagierende Proteine ​​modifiziert, aber nicht nicht bindende Proteine.Zwischenprodukte der Photooxidation werden durch Relaismarkierungen der chemischen Aminsonde abgefangen, um kovalente Addukte zu bilden.Die Alkinylgruppe an der Chemiesonde ermöglicht eine Klick-Chemie zur Anreicherung durch Pulldown, gefolgt von LC-MS/MS-Quantifizierung.b Chemische Struktur der Aminsonden 1-4.c Repräsentative fluoreszierende Gelanalyse von mitochondrialen lokalisierten miniSOG-vermittelten proteomischen Markern unter Verwendung der Sonden 1–4 und relative Quantifizierung basierend auf Geldensitometrie.Das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis chemischer Sonden wurde unter Verwendung von Negativkontrollexperimenten ohne Blaulicht oder unter Verwendung von HEK293T-Zellen ohne miniSOG-Expression bewertet.n = 2 biologisch unabhängige Stichproben.Jeder Punkt repräsentiert eine biologische Nachbildung.d Repräsentativer Nachweis und Quantifizierung von PDPL unter Verwendung der optimierten Sonde 3 in Anwesenheit oder Abwesenheit der angegebenen PDPL-Komponenten wie c.n = 3 biologisch unabhängige Stichproben.Jeder Punkt repräsentiert eine biologische Nachbildung.Mittellinien und Schnurrhaare stellen den Mittelwert und die ± Standardabweichung dar.CBB: Coomassie-Brillantblau.e Konfokale Abbildung von Singulett-Sauerstoff mit dunkelroter Si-DMA-Färbung.Maßstabsbalken: 10 µm.Gelabbildungs- und konfokale Experimente wurden unabhängig voneinander mindestens zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
Wir testeten zunächst die Fähigkeit der reifen Photosensibilisatoren miniSOG26 und KillerRed23, die stabil in HEK293T exprimiert werden, die Propargylamin-Markierung des Proteoms als chemische Sonde zu vermitteln (ergänzende Abb. 1a).Die Gelfluoreszenzanalyse zeigte, dass mit miniSOG und Blaulichtbestrahlung eine Markierung des gesamten Proteoms erreicht wurde, während mit KillerRed kein sichtbares Markierungsprodukt beobachtet wurde.Um das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis zu verbessern, testeten wir dann eine Reihe chemischer Sonden, die Anilin (1 und 3), Propylamin (2) oder Benzylamin (4) enthielten.Wir beobachteten, dass HEK293T-Zellen selbst ein höheres Hintergrundsignal im Vergleich zu keinem blauen Licht aufwiesen, möglicherweise aufgrund des endogenen Riboflavin-Photosensibilisators Flavinmononukleotid (FMN) 27 . Die auf Anilin basierenden chemischen Sonden 1 und 3 ergaben eine bessere Spezifität, wobei HEK293T miniSOG in Mitochondrien stabil exprimierte und einen >8-fachen Anstieg des Signals für Sonde 3 zeigte, während Sonde 2, die in der RNA-Markierungsmethode CAP-seq verwendet wurde, nur ~2,5- facher Signalanstieg, wahrscheinlich aufgrund unterschiedlicher Reaktivitätspräferenzen zwischen RNA und Protein (Abb. 1b, c). Die auf Anilin basierenden chemischen Sonden 1 und 3 ergaben eine bessere Spezifität, wobei HEK293T miniSOG in Mitochondrien stabil exprimierte und einen >8-fachen Anstieg des Signals für Sonde 3 zeigte, während Sonde 2, die in der RNA-Markierungsmethode CAP-seq verwendet wurde, nur ~2,5- facher Signalanstieg, wahrscheinlich aufgrund unterschiedlicher Reaktivitätspräferenzen zwischen RNA und Protein (Abb. 1b, c).Die auf Anilin basierenden chemischen Sonden 1 und 3 zeigten eine bessere Spezifität: HEK293T, das miniSOG in Mitochondrien stabil exprimiert, zeigt eine mehr als 8-fache Signalsteigerung für Sonde 3, während Sonde 2 nur in der CAP-seq-RNA-Markierungsmethode verwendet wird zeigt einen ~2,5-fachen Signalanstieg, wahrscheinlich aufgrund unterschiedlicher Reaktivitätspräferenzen zwischen RNA und Protein (Abb. 1b, c).基于苯胺的化学探针1 和3 具有更好的特异性，HEK293T 在线粒体中稳定表达miniSOG，探针3 的信号增加> 8 倍，而用于RNA 标记方法CAP-seq 的探针2 仅显示~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。" -倍信号增加，可能是由于RNADie auf Anilin basierenden chemischen Sonden 1 und 3 hatten eine bessere Spezifität, HEK293T exprimierte stabil miniSOG in Mitochondrien und Sonde 3 hatte eine über 8-fache Signalsteigerung, während Sonde 2 für die CAP-seq-RNA-Markierungsmethode nur eine ~2,5-fache Steigerung zeigte.im Signal, wahrscheinlich aufgrund unterschiedlicher Reaktionspräferenzen zwischen RNA und Protein (Abb. 1b, c).Darüber hinaus wurden Sonden-3-Isomere und Hydrazin-Sonden (Sonden 5, 6, 7) getestet, was die Optimierung von Sonde 3 bestätigte (ergänzende Fig. 1b, c).In ähnlicher Weise ergab die In-Gel-Fluoreszenzanalyse andere optimierte experimentelle Parameter: Bestrahlungswellenlänge (460 nm), Konzentration der chemischen Sonde (1 mM) und Bestrahlungszeit (20 min) (ergänzende Abb. 2a–c).Das Weglassen einer Komponente oder eines Schritts im PDPL-Protokoll führte zu einer signifikanten Signalumkehr zum Hintergrund (Abb. 1d).Bemerkenswerterweise wurde die Proteinmarkierung in Gegenwart von Natriumazid oder Trolox, von denen bekannt ist, dass sie Singulett-Sauerstoff löschen, signifikant reduziert.Das Vorhandensein von D2O, von dem bekannt ist, dass es Singulett-Sauerstoff stabilisiert, verstärkt das Markierungssignal.Um den Beitrag anderer reaktiver Sauerstoffspezies zur Markierung zu untersuchen, wurden Mannit und Vitamin C hinzugefügt, um Hydroxyl- bzw. Superoxid-Radikalfänger zu etablieren, 18, 29, aber es wurde nicht festgestellt, dass sie die Markierung reduzieren.Die Zugabe von H2O2, aber keine Beleuchtung, führte zu keiner Markierung (ergänzende Abb. 3a).Fluoreszenz-Singulett-Sauerstoff-Bildgebung mit Si-DMA-Sonden bestätigte das Vorhandensein von Singulett-Sauerstoff im HEK293T-miniSOG-Draht, aber nicht im ursprünglichen HEK293T-Draht.Darüber hinaus konnte mitoSOX Red nach der Belichtung keine Superoxidproduktion nachweisen (Abb. 1e und ergänzende Abb. 3b) 30. Diese Daten deuten stark darauf hin, dass Singulett-Sauerstoff die wichtigste reaktive Sauerstoffspezies ist, die für die nachfolgende proteomische Markierung verantwortlich ist.Die Zytotoxizität von PDPL wurde einschließlich Blaulichtbestrahlung und chemischen Sonden bewertet, und es wurde keine signifikante Zytotoxizität beobachtet (ergänzende Abb. 4a).
Um den Markierungsmechanismus zu untersuchen und die proteomische Identifizierung von Proteinkomplexen mit LC-MS/MS zu ermöglichen, müssen wir zunächst bestimmen, welche Aminosäuren modifiziert sind und die Delta-Masse der Sondenmarkierungen.Es wurde berichtet, dass Methionin, Histidin, Tryptophan und Tyrosin durch Singulett-Sauerstoff modifiziert werden14,15.Wir integrieren den TOP-ABPP31-Workflow mit der unvoreingenommenen offenen Suche, die von der FragPipe-Computerplattform auf Basis von MSFragger32 bereitgestellt wird.Nach der Singulett-Sauerstoff-Modifikation und der Markierung mit einer chemischen Sonde wurde eine Klick-Chemie unter Verwendung einer Biotin-Reduktionsmarkierung durchgeführt, die einen spaltbaren Linker enthielt, gefolgt von einer Neutravidin-Streckung und einem Trypsin-Verdau.Das noch an das Harz gebundene modifizierte Peptid wurde für die LC-MS/MS-Analyse photogespalten (Abbildung 2a und Zusatzdaten 1).Im gesamten Proteom trat eine große Anzahl von Modifikationen auf, wobei über 50 Übereinstimmungen der Peptidkarte (PSM) aufgelistet wurden (Abb. 2b).Überraschenderweise beobachteten wir nur eine Modifikation von Histidin, wahrscheinlich aufgrund der höheren Reaktivität von oxidiertem Histidin gegenüber Anilinsonden als andere Aminosäuren.Gemäß dem veröffentlichten Mechanismus der Histidinoxidation durch Singulett-Sauerstoff21,33 entspricht die vorgeschlagene Delta-Massenstruktur von +229 Da dem Addukt von Sonde 3 mit 2-Oxo-Histidin nach zwei Oxidationen, während +247 Da das Hydrolyseprodukt ist von +229 Da (ergänzende Abb. 5).Die Auswertung des MS2-Spektrums zeigte eine hohe Zuverlässigkeit der Identifizierung der meisten y- und b-Ionen, einschließlich der Identifizierung modifizierter Fragment-Ionen (y und b) (Abb. 2c).Die Kontextanalyse der lokalen Sequenz von PDPL-modifizierten Histidinen ergab eine moderate Motivpräferenz für kleine hydrophobe Reste an Positionen von ±1 (ergänzende Fig. 4b).Im Durchschnitt wurden 1,4 Histidine pro Protein identifiziert, und die Stellen dieser Marker wurden durch Analyse der lösungsmittelzugänglichen Oberfläche (SASA) und der relativen Lösungsmittelverfügbarkeit (RSA) bestimmt (ergänzende Abb. 4c, d).
Ein unvoreingenommener Arbeitsablauf zur Untersuchung der Restselektivität mit der FragPipe-Computerplattform powered by MSFragger.Spaltbare Linker werden in der Click-Chemie verwendet, um die Photospaltung modifizierter Peptide von Streptavidin-Harz zu ermöglichen.Eine offene Suche wurde gestartet, um zahlreiche Modifikationen sowie relevante Überbleibsel zu identifizieren.b Ordnen Sie die Masse der Modifikationen zu, die im gesamten Proteom auftreten.Peptidkartierung PSM.c MS2-Spektralanmerkung von mit Sonde 3 modifizierten Histidinstellen. Als repräsentatives Beispiel fügte eine kovalente Reaktion mit Sonde 3 +229,0938 Da zu der modifizierten Aminosäure hinzu.d Mutationsassay zum Testen auf PDPL-Marker.PRDX3 (H155A, H225A) und PRDX1 (H10A, H81A, H169A) wurden mit Wildtyp-Plasmiden für den Anti-Flag-Nachweis transfiziert.e Das synthetische Peptid wurde mit gereinigtem miniSOG in Gegenwart von Sonde 3 umgesetzt und die entsprechenden Produkte mit Δm +247 und +229 wurden im LC-MS-Spektrum festgestellt.f In-vitro-Protein-zu-Protein-Wechselwirkungen, modelliert mit miniSOG-6xHis-Tag und Anti-6xHis-Antikörper.Antibiotin (Streptavidin-HRP) und Anti-Maus-Western-Blot-Analyse von mit Sonde 3 markierten miniSOG-6xHis/Anti-6xHis-Antikörperkomplexen in Abhängigkeit von der Zeit der Lichteinwirkung.Markierungen für einzelne Proteine ​​werden im entsprechenden Molekulargewicht ausgedrückt: LC-Antikörper-Leichtkette, HC-Antikörper-Schwerkette.Diese Experimente wurden unabhängig mindestens zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
Zur biochemischen Verifizierung der Markierungsstelle wurden durch Massenspektrometrie identifiziertes PRDX3 und PRDX1 von Histidin zu Alanin geändert und in Transfektionsassays mit dem Wildtyp verglichen.Die PDPL-Ergebnisse zeigten, dass die Mutation die Markierung signifikant reduzierte (Abb. 2d).In der Zwischenzeit wurden die in der offenen Suche identifizierten Peptidsequenzen synthetisiert und in vitro mit gereinigtem miniSOG in Gegenwart von Sonde 3 und blauem Licht umgesetzt, was Produkte mit einer Massenverschiebung von +247 und +229 Da ergab, wenn sie durch LC-MS nachgewiesen wurde (Abb 2e).).Um zu testen, ob interagierende proximale Proteine ​​​​als Reaktion auf miniSOG-Photoaktivierung in vitro markiert werden könnten, haben wir einen künstlichen Proximity-Assay durch Interaktion zwischen dem miniSOG-6xHis-Protein und einem monoklonalen Anti-His-Antikörper in vitro entwickelt (Abbildung 2f).In diesem Assay erwarteten wir eine proximale Markierung von schweren und leichten Antikörperketten mit miniSOG.Tatsächlich zeigten Anti-Maus- (die die schweren und leichten Ketten von Anti-6xHis-markiertem Antikörper erkennen) und Streptavidin-Western-Blots eine starke Biotinylierung der schweren und leichten Ketten.Insbesondere bemerkten wir die miniSOG-Autobiotinylierung aufgrund des 6xHis-Tags und Querverbindungen zwischen leichten und schweren Ketten, die mit der zuvor beschriebenen Lücke zwischen der proximalen Reaktion von Lysin und 2-Oxo-Histidin zusammenhängen könnten.Abschließend schließen wir, dass PDPL Histidin in einer von der Nähe abhängigen Weise modifiziert.
Unser nächstes Ziel war die Charakterisierung des subzellulären Proteoms, um die Spezifität der In-situ-Markierung zu testen.Daher exprimierten wir miniSOG stabil im Kern, in der mitochondrialen Matrix oder in der äußeren ER-Membran von HEK293T-Zellen (Abb. 3a).Die Gelfluoreszenzanalyse zeigte reichlich markierte Banden an drei subzellulären Stellen sowie unterschiedliche Markierungsmuster (Abb. 3b).Die Analyse der Fluoreszenzbildgebung zeigte eine hohe Spezifität von PDPL (Abb. 3c).Dem PDPL-Workflow folgten Klick-Reaktionen mit Rhodamin-Farbstoffen, um subzelluläre Proteome mittels Fluoreszenzmikroskopie abzugrenzen, und PDPL-Signale wurden mit DAPI, mitochondrialen Trackern oder ER-Trackern kolokalisiert, was die hohe Wiedergabetreue von PDPL bestätigte.Für die drei Organellenorte zeigte ein direkter Vergleich von PDPL mit TurboID unter Verwendung von Avidin-Western-Blot, dass PDPL im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollen spezifischer markiert wurde.Unter PDPL-Bedingungen erschienen mehr markierte Banden, was auf mehr PDPL-markierte Proteine ​​hinweist (ergänzende Abb. 6a-d).
a Schematische Darstellung der miniSOG-vermittelten organellenspezifischen Proteommarkierung.miniSOG zielt auf die mitochondriale Matrix durch Fusion mit den N-terminalen 23 Aminosäuren des menschlichen COX4 (Mito-miniSOG), den Kern durch Fusion mit H2B (Nukleus-miniSOG) und Sec61β über die zytoplasmatische Seite der ER-Membran (ER-miniSOG). ).Zu den Indikationen gehören Gelbildgebung, konfokale Bildgebung und Massenspektrometrie.b Repräsentative Gelbilder von drei Organellen-spezifischen PDPL-Profilen.CBB Coomassie Brillantblau.c Repräsentative konfokale Bilder von HEK293T-Zellen, die miniSOG stabil exprimieren, mit unterschiedlichen subzellulären Lokalisationen, die durch mit Antikörper markiertem V5 (rot) erkannt werden.Subzelluläre Marker werden für Mitochondrien und ER (grün) verwendet.Der PDPL-Workflow umfasst den Nachweis von miniSOG (gelb) markierten subzellulären Proteomen mithilfe der Cy3-Azid-Click-Chemie.Maßstabsbalken: 10 µm.d Vulkandiagramme von PDPL-markierten Proteomen in verschiedenen Organellen, quantifiziert durch unbeschriftete Quantifizierung (n = 3 unabhängige biologische Experimente).Der zweiseitige Student's t-Test wurde bei Vulkanplots verwendet.Als Negativkontrolle wurde der HEK293T-Wildtyp verwendet. Signifikant veränderte Proteine ​​sind rot hervorgehoben (p < 0,05 und > 2-facher Ionenintensitätsunterschied). Signifikant veränderte Proteine ​​sind rot hervorgehoben (p < 0,05 und > 2-facher Ionenintensitätsunterschied). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Signifikant veränderte Proteine ​​sind rot hervorgehoben (p < 0,05 und > 2-facher Unterschied in der Ionenintensität).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Signifikant veränderte Proteine ​​sind rot hervorgehoben (p < 0,05 und > 2-facher Unterschied in der Ionenstärke).Verwandte Proteine, die für HEK293T-miniSOG wichtig, aber für HEK293T nicht wichtig sind, sind grün dargestellt.e Analyse der Spezifität proteomischer Datensätze aus Experimenten d.Die Gesamtzahl der statistisch signifikanten Proteine ​​in jeder Organelle (rote und grüne Punkte) ist oben markiert.Histogramme zeigen Proteine, die in Organellen lokalisiert sind, basierend auf MitoCarta 3.0, GO-Analyse und A. Ting et al.Personen.Separate Datensätze für Mitochondrien, Kerne und ER.Diese Experimente wurden unabhängig mindestens zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.Rohdaten werden in Form von Rohdatendateien bereitgestellt.
Ermutigt durch die Gel- und Bildgebungsergebnisse wurde eine markierungsfreie Quantifizierung verwendet, um das identifizierte Proteom in jeder Organelle zu quantifizieren (Ergänzungsdaten 2).Untransfiziertes HEK293T wurde als Negativkontrolle verwendet, um Hintergrundmarker zu subtrahieren. Die Volcano-Plot-Analyse zeigte signifikant angereicherte Proteine ​​(p < 0,05 und > 2-fache Ionenintensität) sowie Singleton-Proteine, die nur in miniSOG-exprimierenden Linien vorhanden sind (Abb. 3d, rote und grüne Punkte). Die Volcano-Plot-Analyse zeigte signifikant angereicherte Proteine ​​(p < 0,05 und > 2-fache Ionenintensität) sowie Singleton-Proteine, die nur in miniSOG-exprimierenden Linien vorhanden sind (Abb. 3d, rote und grüne Punkte). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Die Volcano-Plot-Analyse zeigte signifikant angereicherte Proteine ​​(p < 0,05 und > 2-fache Ionenintensität) sowie einzelne Proteine, die nur in miniSOG-exprimierenden Linien vorhanden sind (Abb. 3d, rote und grüne Punkte).火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 蛋白质 （p <0,05 和> 2 倍 强度） 以及 仅 仅 存 在于 Minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 和））。。。 中 的 蛋白质 （图 红色 绿色点）。。。 中 的 单一 蛋白质 红色 和）。。。 中 中 的 单一 蛋白质 绿色点）。。。 中 中 的 单一 蛋白质 和）。。。 中 的 单一 蛋白质 图 红色 绿色点）。。 中 的 蛋白质 （图 图 绿色点）。。 中 中 的 蛋白质 （图 图 红色 绿色点）。。。。" Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Die Volcan-Plot-Analyse ergab signifikant angereicherte Proteine ​​(p < 0,05 und > 2x Ionenstärke) sowie einzelne Proteine, die nur in der miniSOG-Expressionslinie vorhanden sind (rote und grüne Punkte in Abb. 3d).Durch Kombinieren dieser Daten identifizierten wir 1364, 461 bzw. 911 statistisch signifikante Kern-, Mitochondrien- bzw. ER-Außenmembranproteine.Um die Genauigkeit der Organellen-lokalisierten PDPL zu analysieren, verwendeten wir MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO)-Analyse und A. Ting et al.ein Datensatz8 wurde für Mitochondrien, Kern und ER verwendet, um die Organellenspezifität der detektierten Proteine ​​zu testen, was einer Genauigkeit von 73,4, 78,5 und 73,0 % entspricht (Abb. 3e).Die Spezifität von PDPL bestätigt, dass PDPL ein ideales Werkzeug zur Identifizierung von Organellen-spezifischen Proteomen ist.Bemerkenswerterweise zeigte die Submitochondrienanalyse von identifizierten mitochondrialen Proteinen, dass das eingeschlossene Proteom hauptsächlich in der Matrix und der inneren Membran (226 bzw. 106) verteilt war und 91,7 % (362) der Gesamtzahl identifizierter mitochondrialer Proteine ​​ausmachte.ein hoher PDPL-Wert wurde zusätzlich bestätigt (ergänzende Abb. 7a).In ähnlicher Weise zeigte die subnukleäre Analyse, dass das eingefangene Proteom hauptsächlich im Kern, Nukleoplasma und Nukleolus verteilt war (ergänzende Abb. 7b).Die Kernproteomikanalyse mit einem Kernlokalisierungssignalpeptid (3xNLS) zeigte eine ähnliche Genauigkeit wie das H2B-Konstrukt (ergänzende Abb. 7c – h).Um die Spezifität des PDPL-Markers zu bestimmen, wurde nukleäres Laminin A als eine diskreter lokalisierte POI7-Falle gewählt.PDPL identifizierte 36 signifikant angereicherte Proteine, von denen 12 Proteine ​​(30,0 % einschließlich Lamin A) gut charakterisierte mit Lamin A interagierende Proteine ​​waren, die von der String-Datenbank kommentiert wurden, mit einem höheren Prozentsatz als die BioID-Methode (122 Proteine) 28 von 28. , 22.9 %) 7. Unser Verfahren identifizierte weniger Proteine, möglicherweise aufgrund begrenzter Markierungsbereiche, was durch mehr aktiven Singulett-Sauerstoff ermöglicht wurde.Die GO-Analyse zeigte, dass die identifizierten Proteine ​​hauptsächlich im Nukleoplasma (26), der Kernmembran (10), der Kernmembran (9) und den Kernporen (5) lokalisiert waren.Zusammen machten diese im Kern lokalisierten Proteine ​​80 % der angereicherten Proteine ​​aus, was die Spezifität von PDPL weiter demonstriert (ergänzende Abb. 8a–d).
Nachdem wir die Fähigkeit von PDPL zur Durchführung von Näherungsmarkierungen in Organellen festgestellt hatten, testeten wir dann, ob PDPL zur Analyse von POI-Bindungspartnern verwendet werden könnte.Insbesondere haben wir versucht, die PDPL-Analyse von zytosolischen Proteinen zu definieren, die aufgrund ihrer hochdynamischen Natur als schwierigere Ziele gelten als ihre membranlokalisierten Gegenstücke.Die Bromodomäne und das extraterminale (BET) Protein BRD4 hat unsere Aufmerksamkeit wegen seiner Schlüsselrolle bei verschiedenen Krankheiten auf sich gezogen 35, 36 .Der von BRD4 gebildete Komplex ist ein Transkriptionskoaktivator und ein wichtiges therapeutisches Ziel.Durch die Regulierung der Expression von c-myc- und Wnt5a-Transkriptionsfaktoren gilt BRD4 als Schlüsselfaktor für akute myeloische Leukämie (AML), multiples Myelom, Burkitt-Lymphom, Dickdarmkrebs und entzündliche Erkrankungen37,38.Darüber hinaus zielen einige Viren auf BRD4 ab, um die virale und zelluläre Transkription zu regulieren, wie Papillomavirus, HIV und SARS-CoV-236,39.
Um die BRD4-Interaktion mit PDPL abzubilden, haben wir miniSOG mit einer kurzen N- oder C-terminalen Isoform von BRD4 kombiniert.Proteomische Ergebnisse zeigten einen hohen Grad an Überlappung zwischen den beiden Konstrukten (ergänzende Abb. 9a).Das mit miniSOG-H2B identifizierte Kernproteom deckt 77,6 % der Proteine ​​ab, die mit BRD4 interagieren (ergänzende Abb. 9b).Dann wurden verschiedene Belichtungszeiten (2, 5, 10, 20 min) verwendet, um den Markerradius einzustellen (Abb. 4a und ergänzende Daten 3).Wir schließen daraus, dass PDPL bei kürzeren Photoperioden hauptsächlich direkte Bindungspartner markiert, während längere Perioden Proteine ​​enthalten, die während kürzerer Photoaktivierungsperioden identifiziert wurden, sowie indirekte Ziele in Markierungskomplexen.Tatsächlich fanden wir eine starke Überlappung zwischen benachbarten Zeitpunkten (84,6 % für 2 und 5 min; 87,7 % für 5 und 10 min; 98,7 % für 10 und 20 min) (Abb. 4b und ergänzende Abb. 9c).In allen experimentellen Gruppen fanden wir nicht nur BRD4-Selbstmarkierung, sondern mehrere bekannte Ziele wie MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A und HMGB1, die in der String-Datenbank annotiert sind.Die Ionenstärke dieser Ziele ist proportional zur Belichtungszeit (Abb. 4c und ergänzende Abb. 9d).Die GO-Analyse der in der 2-Minuten-Gruppe identifizierten Proteine ​​zeigte, dass die identifizierten Proteine ​​im Zellkern lokalisiert und am Chromatin-Remodeling und der RNA-Polymerase-Funktion beteiligt waren.Die molekulare Funktion des Proteins wurde durch Chromatinbindung oder Transkriptionskoaktivierung angereichert, was mit der BRD4-Funktion übereinstimmt (Abb. 4d).Die datenbankgestützte Proteininteraktionsanalyse ergab eine erste Ebene indirekter Wechselwirkungen zwischen BRD4 und den interagierenden Komplexen der HDAC-Familie wie SIN3A, NCOR2, BCOR und SAP130 (Abb. 4e und ergänzende Abb. 9e), die mit der Bindung von BRD4 und HDAC an acetylierte Histone übereinstimmen ..Darüber hinaus wurden repräsentative Ziele, die durch LC-MS/MS identifiziert wurden, einschließlich Sin3A, NSUN2, Fus und SFPQ, durch Western Blotting bestätigt (Abb. 4f).Kürzlich wurde berichtet, dass die kurze Isoform von BRD4 Kerne mit Flüssig-Flüssig-Phasentrennungs(LLPS)-Eigenschaften bildet.Die RNA-bindenden Proteine ​​Fus und SFPQ vermitteln die LLPS verschiedener zellulärer Prozesse und wurden hier als nicht erfasste BRD4-bindende Proteine ​​identifiziert.Die Wechselwirkung zwischen BRD4 und SFPQ wurde durch Co-Immunopräzipitations(co-IP)-Experimente bestätigt (Abbildung 4g), was auf einen anderen Mechanismus für die BRD4-vermittelte Flüssig-Flüssig-Phasentrennung hindeutet, der weitere Untersuchungen verdient.Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass PDPL eine ideale Plattform zur Identifizierung bekannter mit BRD4 interagierender sowie unbekannter Bindungsproteine ​​ist.
a Schematische Darstellung der miniSOG-vermittelten BRD4-Proximity-Markierung, Expositionszeiten: 2, 5, 10 und 20 min.b Überlappung von Proteinen, die zu unterschiedlichen Belichtungszeiten identifiziert wurden.Die in HEK293T-miniSOG-BRD4 identifizierte Proteinanreicherung war im Vergleich zu Wildtyp-HEK293T statistisch signifikant.c Ionenintensität bei der Quantifizierung unmarkierter repräsentativer bekannter BRD4-bindender Proteine ​​während der angegebenen Expositionszeit.n = 3 biologisch unabhängige Stichproben.Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt.d Genontologische Analyse (GO) von Proteinen, die in der 2-Minuten-Gruppe identifiziert wurden.Die ersten zehn GO-Begriffe werden aufgelistet.Die Blasen sind entsprechend der GO-Begriffskategorie gefärbt, und die Blasengröße ist proportional zur Anzahl der in jedem Begriff gefundenen Proteine.e Stringanalyse von Proteinen, die mit BRD4 interagieren.Die gelben Kreise sind direkter Kleber und die grauen Kreise sind die erste Schicht indirekter Kleber.Die roten Linien repräsentieren die experimentell bestimmten Wechselwirkungen und die blauen Linien die vorhergesagten Wechselwirkungen.f Repräsentative BRD4-Bindungsziele, die in LC-MS/MS identifiziert wurden, wurden durch Western-Blotting verifiziert.g Co-Immunpräzipitationsexperimente bestätigen die Wechselwirkung zwischen SFPQ und BRD4.Diese Experimente wurden unabhängig mindestens zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.Rohdaten werden in Form von Rohdatendateien bereitgestellt.
Zusätzlich zur Identifizierung von nicht registrierten POI-assoziierten Zielen nehmen wir an, dass PDPL zur Identifizierung von Substraten für Enzyme geeignet sein wird, was die Charakterisierung von indirekt bindenden Proteinen in großen Komplexen erfordern würde, um nicht registrierte Substrate zu kommentieren.Parkin (kodiert durch PARK2) ist eine E3-Ligase und Mutationen in Parkin sind dafür bekannt, autosomal-rezessive juvenile Parkinson-Krankheit (AR-JP)42 zu verursachen.Darüber hinaus wurde Parkin als essentiell für die Mitophagie (mitochondriale Autophagie) und die Entfernung reaktiver Sauerstoffspezies beschrieben.Obwohl mehrere Parkin-Substrate identifiziert wurden, bleibt die Rolle von Parkin bei dieser Krankheit unklar.Um seine uncharakterisierten Substrate zu kommentieren, wurde PDPL durch Zugabe von miniSOG zum N- oder C-Terminus von Parkin getestet.Die Zellen wurden mit dem Carbonylcyanid-Protonentransporter m-Chlorphenylhydrazon (CCCP) behandelt, um Parkin über den PINK1-Parkin-Weg zu aktivieren.Im Vergleich zu unseren BRD4-PDPL-Ergebnissen ergab die Parkin-N-Terminus-Fusion einen größeren Satz von Zielproteinen, obwohl sie einen größeren Teil des C-Terminus abdeckte (177 von 210) (Abbildung 5a, b und ergänzende Daten 4).das Ergebnis stimmt mit Berichten überein, dass N-terminale Tags Parkin44 abweichend aktivieren können.Überraschenderweise gab es in unseren Daten mit veröffentlichten AP-MS-Ergebnissen für Parkin43 nur 18 überlappende Proteine, wahrscheinlich aufgrund von Unterschieden zwischen Zelllinien und Proteomik-Arbeitsabläufen.Zusätzlich zu vier bekannten Proteinen (ARDM1, HSPA8, PSMD14 und PSMC3), die durch zwei Methoden identifiziert wurden (Abb. 5c)43.Um die Ergebnisse der LC-MS/MS weiter zu validieren, wurden eine PDPL-Behandlung und ein anschließendes Western-Blotting verwendet, um die Ergebnisse des HEK293T-Elternzellen-Assays und der stabilen N-terminalen Parkin-Linie zu vergleichen.Die bisher unbekannten Ziele CDK2, DUT, CTBP1 und PSMC4 wurden mit einem bekannten Binder, DNAJB1, getestet (Abb. 5d).
Volcano-Plot von Parkin-interagierenden Proteinen in HEK293T-Zellen mit stabil exprimiertem miniSOG, fusioniert an den N- oder C-Terminus von Parkin (n = 3 unabhängige biologische Experimente).Der zweiseitige Student's t-Test wurde bei Vulkanplots verwendet.HEK293T wurde als Negativkontrolle verwendet. Signifikant veränderte Proteine ​​sind rot hervorgehoben (p < 0,05 und > 2-facher Ionenintensitätsunterschied). Signifikant veränderte Proteine ​​sind rot hervorgehoben (p < 0,05 und > 2-facher Ionenintensitätsunterschied). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Signifikant veränderte Proteine ​​sind rot hervorgehoben (p < 0,05 und > 2-facher Unterschied in der Ionenintensität).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Signifikant veränderte Proteine ​​sind rot hervorgehoben (p < 0,05 und > 2-facher Unterschied in der Ionenstärke).Verwandte Proteine, die für HEK293T-miniSOG wichtig, aber für HEK293T nicht wichtig sind, sind grün dargestellt.b Venn-Diagramm, das überlappende Proteine ​​zwischen N-terminalen und C-terminalen Konstrukten zeigt.N-terminale Tags können Parkin abweichend aktivieren und zu besser erkennbaren Proteinen führen.c Venn-Diagramm, das überlappende Proteine ​​zwischen PDPL und AP-MS zeigt.Bekannte Interaktoren sind aufgelistet, einschließlich 4 von 18 überlappenden Proteinen und 11 von 159 Proteinen, die spezifisch in PDPL identifiziert wurden.d Durch LC-MS/MS identifizierte repräsentative Ziele wurden durch Western-Blotting verifiziert.e Ssu72 und SNW1 wurden als nicht registrierte Parkin-Substrate identifiziert.Diese FLAG-markierten Proteinplasmide wurden in HEK293T und HEK293T-Parkin-miniSOG transfiziert, gefolgt von einer CCCP-Behandlung zu verschiedenen Zeitpunkten.Der Abbau war in der Parkin-Überexpressionslinie ausgeprägter.f Unter Verwendung des Proteasom-Inhibitors MG132 wurde bestätigt, dass der Abbauprozess von Ssu72 und SNW1 durch Proteasom-Ubiquitinierung vermittelt wird.Diese Experimente wurden unabhängig mindestens zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.Rohdaten werden in Form von Rohdatendateien bereitgestellt.
Insbesondere müssen die durch PDPL identifizierten Proteine ​​Parkin-bindende Proteine ​​und ihre Substrate umfassen.Um nicht registrierte Parkin-Substrate nachzuweisen, haben wir sieben identifizierte Proteine ​​(PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 und SNW1) ausgewählt und Plasmide transfiziert, um diese Gene normalem HEK293T auszusetzen und HEK293T von miniSOG-Parkin stabil zu exprimieren, gefolgt von einer CCCP-Behandlung.Die Spiegel von Ssu72- und SNW1-Proteinen waren in der stabilen miniSOG-Parkin-Linie signifikant reduziert (Abb. 5e).Die 12-stündige Behandlung mit CCCP führte zum signifikantesten Abbau beider Substrate.Um zu untersuchen, ob der Abbau von Ssu72 und SNW1 durch Proteasom-Ubiquitinierung reguliert wird, wurde der Proteasom-Inhibitor MG132 hinzugefügt, um die Proteasom-Aktivität zu hemmen, und tatsächlich fanden wir heraus, dass ihr Abbauprozess gehemmt wurde (Abb. 5f).Zusätzliche Nicht-Substrat-Ziele wurden als Parkin-Interaktoren mittels Western-Blotting bestätigt (ergänzende Abb. 10), die konsistente Ergebnisse mit LC-MS/MS zeigten.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Integration des PDPL-Workflows mit der Überprüfung der Zielproteintransfektion die Identifizierung von nicht registrierten E3-Ligasesubstraten ermöglicht.
Wir haben eine gemeinsame Umgebungsmarkierungsplattform entwickelt, mit der Sie räumlich und zeitlich interagierende POIs identifizieren können.Die Plattform basiert auf dem Photosensibilisator-Protein miniSOG, das mit nur etwa 12 kDa weniger als halb so groß ist wie das reife APEX2-Enzym (27 kDa) und ein Drittel so groß wie TurboID (35 kDa).Die kleinere Größe sollte den Anwendungsbereich für die Untersuchung kleiner Protein-Interaktome erheblich erweitern.Die weitere Erforschung zusätzlicher Photosensibilisatoren, seien es genetisch codierte Proteine ​​oder kleine Moleküle, ist erforderlich, um die Quantenausbeute von Singulett-Sauerstoff zu erhöhen und die Empfindlichkeit dieses Ansatzes zu erweitern.Für die aktuelle Version von miniSOG kann eine hohe zeitliche Auflösung erreicht werden, indem blaue Beleuchtung verwendet wird, um Näherungsmarker zu aktivieren.Darüber hinaus setzte eine längere Expositionszeit eine größere „Wolke“ von Singulett-Sauerstoff frei, was zu einer Modifikation von weiter distal gelegenen Histidinresten, einem vergrößerten Markierungsradius und der Fähigkeit zur Feinabstimmung der räumlichen Auflösung von PDPL führte.Wir haben auch sieben chemische Sonden getestet, um das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis zu erhöhen, und den molekularen Mechanismus hinter diesem Ansatz untersucht.Der TOP-ABPP-Arbeitsablauf in Kombination mit einer unvoreingenommenen offenen Suche bestätigte, dass Modifikationen nur in Histidinen auftraten und keine konsistente Mikroumgebung für erhöhte Histidinmodifikationen beobachtet wurde, mit Ausnahme einer moderaten Präferenz für Histidinen in der Schleifenregion.
PDPL wurde auch verwendet, um subzelluläre Proteome mit Proteomspezifität und -abdeckung zu charakterisieren, die zumindest vergleichbar mit anderen Proximity-Labeling- und Organellen-spezifischen chemischen Sondenmethoden sind.Annäherungsmarker wurden auch erfolgreich verwendet, um die Oberflächen-, lysosomalen und Sekretom-assoziierten Proteome zu charakterisieren46,47.Wir glauben, dass PDPL mit diesen subzellulären Organellen kompatibel sein wird.Darüber hinaus forderten wir PDPL heraus, indem wir Ziele für die zytosolische Proteinbindung identifizierten, die aufgrund ihrer dynamischen Eigenschaften und Beteiligung an zeitlicheren Wechselwirkungen komplexer sind als membrangebundene Proteine.PDPL wurde auf zwei Proteine ​​angewendet, den Transkriptionskoaktivator BRD4 und die krankheitsassoziierte Ligase E3 Parkin.Diese beiden Proteine ​​wurden nicht nur aufgrund ihrer grundlegenden biologischen Funktionen ausgewählt, sondern auch aufgrund ihrer klinischen Relevanz und ihres therapeutischen Potenzials.Für diese beiden POIs wurden sowohl bekannte Bindungspartner als auch nicht registrierte Ziele identifiziert.Insbesondere wurde das Phasentrennungs-assoziierte Protein SFPQ durch co-IP bestätigt, was auf einen neuen Mechanismus hinweisen könnte, durch den BRD4 (kurze Isoform) LLPS reguliert.Gleichzeitig glauben wir, dass die Identifizierung von Parkin-Substraten ein Szenario ist, in dem die Identifizierung von indirekten Klebstoffen erforderlich ist.Wir identifizierten zwei unidentifizierte Parkin-Substrate und bestätigten ihren Abbau entlang des Ubiquitinations-Proteasom-Signalwegs.Kürzlich wurde eine Mechanismus-basierte Einfangstrategie entwickelt, um Hydrolase-Substrate nachzuweisen, indem sie mit Enzymen eingefangen werden.Obwohl dies ein sehr leistungsfähiges Verfahren ist, ist es nicht für die Analyse von Substraten geeignet, die an der Bildung großer Komplexe beteiligt sind, und erfordert die Bildung kovalenter Bindungen zwischen dem Enzym und dem Substrat.Wir gehen davon aus, dass PDPL erweitert werden kann, um andere Proteinkomplexe und Enzymfamilien wie die Deubiquitinase- und Metalloprotease-Familien zu untersuchen.
Eine neue Form von miniSOG namens SOPP3 wurde mit verbesserter Singulett-Sauerstoffproduktion entwickelt.Wir haben miniSOG mit SOPP3 verglichen und eine verbesserte Markierungsleistung festgestellt, obwohl das Signal-Rausch-Verhältnis unverändert blieb (ergänzende Abb. 11).Wir stellten die Hypothese auf, dass die Optimierung von SOPP3 (z. B. durch gerichtete Evolution) zu effizienteren Photosensibilisatorproteinen führen würde, die kürzere Lichtzeiten benötigen und somit die Erfassung dynamischerer zellulärer Prozesse ermöglichen würden.Insbesondere ist die aktuelle Version von PDPL auf die zelluläre Umgebung beschränkt, da sie eine Blaulichtbeleuchtung erfordert und nicht in tiefe Gewebe eindringen kann.Dieses Merkmal schließt seine Verwendung in Tiermodellstudien aus.Die Kombination von Optogenetik mit PDPL könnte jedoch eine Chance für Tierversuche bieten, insbesondere im Gehirn.Darüber hinaus beseitigen auch andere konstruierte Infrarot-Photosensibilisatoren diese Einschränkung.Auf diesem Gebiet wird derzeit geforscht.
Die HEK293T-Zelllinie wurde von ATCC (CRL-3216) erhalten.Die Zelllinie wurde negativ auf eine Mycoplasma-Infektion getestet und in DMEM (Thermo, Nr. C11995500BT) kultiviert, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Vistech, Nr. SE100-B) und 1 % Penicillin/Streptomycin (Hyclone, Nr. SV30010) ergänzt war.eingewachsen.
3-Aminophenylen (Probe 3) und (4-Ethinylphenyl)methanamin (Probe 4) wurden von Bidepharm bezogen.Propylamin (Sonde 2) wurde von Energy-Chemicals gekauft.N-(2-Aminophenyl)pent-4-inamid (Sonde 1) wurde gemäß veröffentlichten Verfahren synthetisiert.
Ergänzende Tabelle 1 listet die in dieser Studie verwendeten genetischen Konstrukte auf.Die miniSOG- und KillerRed-Sequenzen wurden aus einem Geschenkplasmid von P. Zou (Peking University) kloniert.Die mitochondriale Matrix-Targeting-Sequenz wurde von den 23 N-terminalen Aminosäuren von COX4 abgeleitet und unter Verwendung einer Gibson-Anordnung (Beyotime, #D7010S) in die angegebenen Vektoren kloniert.Um auf die Membran und den Kern des endoplasmatischen Retikulums abzuzielen, wurden menschliche SEC61B-DNA (NM_006808.3) (NEB, Nr. M0491L), die durch PCR aus einer cDNA-Bibliothek von HEK293T-Zellen amplifiziert wurde, und H2B-DNA (gespendet von D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) und geklont, wie oben erwähnt.Sofern nicht anders angegeben, wurden andere Proteingene, die zur Transfektion und Konstruktion stabiler Zelllinien verwendet wurden, aus der HEK293T-Zell-cDNA-Bibliothek PCR-amplifiziert.G3S (GGGS) und G4S (GGGGS) wurden als Linker zwischen dem Köderprotein und miniSOG verwendet.Diesen Fusionskonstrukten wurde ein V5-Epitop-Tag (GKPIPNPLLGLDST) hinzugefügt.Zur Expression in Säugetieren und zur Etablierung einer stabilen Zelllinie wurde das miniSOG-Fusionskonstrukt in den lentiviralen Vektor pLX304 subkloniert.Für die bakterielle Expression wurde miniSOG in den am C-Terminus mit 6xHis markierten pET21a-Vektor kloniert.
HEK293T-Zellen wurden mit 2,0 x 105 Zellen pro Vertiefung in Platten mit sechs Vertiefungen ausgesät und 24 Stunden später mit rekombinanten lentiviralen Plasmiden (2,4 μg pLX304) und viralen Verpackungsplasmiden (1,5 μg psPAX2 und 1,2 μg pMD2.G) unter Verwendung von Lipo8000 (Beyotime , #C0533), etwa 80 % Verschmelzung.Nach Transfektion über Nacht wurde das Medium gewechselt und weitere 24 Stunden inkubiert.Die Sammlung des Virus erfolgte nach 24, 48 und 72 Stunden.Vor der Infektion der Zielzelllinien wurde das virale Medium durch einen 0,8 &mgr;m-Filter (Merck, Nr. Millex-GP) filtriert und Polybrene (Solarbio, Nr. H8761) wurde bis zu einer Konzentration von 8 &mgr;g/ml zugegeben.Nach 24 Stunden durften sich die Zellen durch Wechseln des Mediums erholen.Zellen wurden unter Verwendung von 5 &mgr;g/ml Blasticidin (Solarbio, Nr. 3513-03-9) für die ersten drei Passagen als weniger stringente Selektion selektiert.Dann wurden 20 &mgr;g/ml als strengeres Schema für die nächsten drei Passagen verwendet.
Die Zellen wurden in Kammern mit 12 Vertiefungen (Ibidi, Nr. 81201) mit einer Dichte von etwa 20.000 Zellen pro Vertiefung ausgesät.Um die Adhäsion von HEK293T-Zellen zu verbessern, fügen Sie 50 µg/ml Fibronektin (Corning, Nr. 356008), verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, Sangon, Nr. B640435) bei 37 °C hinzu.Die Kammern wurden 1 Stunde vorbehandelt und dann mit PBS entfernt.Nach 24 h wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen, mit 1 mM Sonde 3 in frischer balancierter Salzlösung von Hanks (HBSS, Gibco, Nr. 14025092) für 1 h bei 37 °C inkubiert und dann mit einer blauen LED (460 nm) inkubiert ).) wurden 10 min bei Raumtemperatur bestrahlt.Danach wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit 4 % Formaldehyd in PBS (Sangon, #E672002) für 15 Minuten bei Raumtemperatur fixiert.Überschüssiges Formaldehyd wurde von den fixierten Zellen durch dreimaliges Waschen mit PBS entfernt.Die Zellen wurden dann mit 0,5 % Triton X-100 (Sangon, Nr. A600198) in PBS permeabilisiert und dreimal mit PBS gewaschen.Entfernen Sie dann die Kammer und geben Sie zu jeder Probe 25 µl einer Click-Reaktionsmischung hinzu, die 50 µM Cy3-Azid (Aladdin, Nr. C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, Nr. A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, Nr. BDJ-4) enthält. und 0,5 mg/ml Natriumascorbat (Aladdin, Nr. S105024) gegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.Nach einer Schnellreaktion wurden die Zellen sechsmal mit PBS gewaschen, das 0,05 % Tween-20 (Sangon, Nr. A600560) (PBST) enthielt, und dann mit 5 % BSA (Abcone, Nr. B24726) in PBST für 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert.
Für die Kolokalisierungs-Immunfärbung wurden die Zellen mit primären Antikörpern gemäß den angegebenen Bedingungen inkubiert: Maus-Anti-V5-Tag-mAb (1:500, CST, #80076), Kaninchen-Anti-Hsp60-mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), Polyklonaler Kaninchen-Anti-Calnexin-Antikörper (1:500, Abcam, #ab22595) oder Kaninchen-Anti-Lamin-A/C-monoklonaler Antikörper (1:500; CST, #2032) bei 4°C über Nacht.Nach dreimaligem Waschen mit PBST wurden die Zellen mit sekundären Antikörpern inkubiert: Ziegen-Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) verdünnt 1:1000, Ziegen-Anti-Maus Alexa Fluor 594 (CST, #8889) verdünnt 1:1000.Verdünnung 30 Minuten bei Raumtemperatur verdünnen.Die Zellen wurden dann dreimal mit PBST gewaschen und mit DAPI (Thermo, #D1306) in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur gegengefärbt.Nach 3 Waschgängen mit PBS wurden die Zellen in 50 % Glycerol (Sangon, Nr. A600232) in PBS zur Abbildung versiegelt.Immunfluoreszenzbilder wurden unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops ZEISS LSM 900 Airyscan2 und der Software ZNE 3.5 erhalten.
Für die Singulett-Sauerstoff-Fluoreszenz-Bildgebung wurden die Zellen zweimal mit Hanks-HEPES-Puffer gewaschen, bevor 100 nM Si-DMA in Hanks-HEPES-Puffer (DOJINDO, #MT05) zugegeben wurden.Nach Lichteinwirkung wurden die Zellen 45 Minuten bei 37°C in einem CO 2 -Inkubator inkubiert.Die Zellen wurden dann zweimal mit HEPES-Puffer von Hanks gewaschen und mit Hoechst in HEPES-Puffer von Hanks für 10 Minuten bei Raumtemperatur gegengefärbt und unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops ZEISS LSM 900 sichtbar gemacht., #M36008) in HBSS-Puffer, der Calcium und Magnesium enthält.Nach Einwirkung von Licht oder Doxorubicin (MCE, Nr. HY-15142A) wurden die Zellen in einem CO 2 -Inkubator bei 37°C für 10 Minuten inkubiert, zweimal mit HBSS-Puffer gewaschen und mit Hoechst in HBSS-Puffer bei Raumtemperatur inkubiert.Protokoll.Doxorubicin wurde als positive Sondenkontrolle verwendet, wobei Zellen mit 20 &mgr;M Doxorubicin in HBSS, enthaltend 1 % BSA, für 30 Minuten behandelt wurden.Immunfluoreszenzbilder wurden unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops Zeiss LSM 900 erhalten.
HEK293T-Zellen, die Mito-miniSOG stabil exprimieren, wurden mit einer Dichte von etwa 30 % in 15-cm-Schalen ausgesät.Nach 48 Stunden, als ~80 % Konfluenz erreicht waren, wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen, mit 1 mM Sonde 3 in frischem HBSS-Puffer für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert und dann mit einer blauen LED für 10 Minuten bei Raumtemperatur beleuchtet Temperatur..Danach wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, abgekratzt und in eiskaltem PBS-Puffer resuspendiert, der EDTA-freie Protease-Inhibitoren (MCE, #HY-K0011) enthielt.Die Zellen wurden lysiert, indem die Spitze 1 Minute lang beschallt wurde (1 Sekunde an und 1 Sekunde aus bei 35 % Amplitude).Die resultierende Mischung wurde bei 15.871 × g für 10 min bei 4°C zentrifugiert, um Debris zu entfernen, und die Überstandskonzentration wurde unter Verwendung eines BCA-Protein-Assay-Kits (Beyotime, #P0009) auf 4 mg/ml eingestellt.Kombinieren Sie 1 ml des obigen Lysats mit 0,1 mM photoabbaubarem Biotinazid (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA-Ligand (Aladdin, #T162437) und 1 mM CuSO4-Inkubator mit Boden 1 Stunde bei Raumtemperatur aufdrehen.Geben Sie nach einer Schnellreaktion die Mischung zu der vorgemischten Lösung (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) in einem 10-ml-Glasfläschchen.Die Proben wurden gemischt und bei 4500 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.Die untere und obere Lösung wurden verworfen, der Niederschlag zweimal mit 1 ml Methanol gewaschen und bei 15871 xg für 5 min bei 4°C zentrifugiert.1 ml 8 M Harnstoff (Aladdin, Nr. U111902) in 25 mM Ammoniumbicarbonat (ABC, Aladdin, Nr. A110539) zugeben, um den Niederschlag aufzulösen.Die Proben wurden mit 10 mM Dithiothreitol (Sangon, #A100281 in 25 mM ABC) für 40 Minuten bei 55°C rekonstituiert, gefolgt von der Zugabe von 15 mM frischem Jodacetamid (Sangon, #A600539) bei Raumtemperatur im Dunkeln.Alkylierung innerhalb von 30 Minuten..Weitere 5 mM Dithiothreitol wurden zugegeben, um die Reaktion zu stoppen.Bereiten Sie etwa 100 µl NeutrAvidin-Agarose-Kügelchen (Thermo, Nr. 29202) für jede Probe vor, indem Sie dreimal mit 1 ml PBS waschen.Die obige Proteomlösung wurde mit 5 ml PBS verdünnt und mit vorgewaschenen NeutrAvidin-Agarosekügelchen für 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.Die Kügelchen wurden dann dreimal mit 5 ml PBS, enthaltend 0,2 % SDS (Sangon, #A600485), dreimal mit 5 ml PBS, enthaltend 1 M Harnstoff, und dreimal mit 5 ml ddH 2 O gewaschen.Die Kügelchen wurden dann durch Zentrifugation geerntet und in 200 &mgr;l 25 mM ABC, enthaltend 1 M Harnstoff, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) und 20 ng/μl Trypsin (Promega, #V5280), resuspendiert.Trypsinieren über Nacht bei 37°C unter Rotation.Die Reaktion wurde durch Zugabe von Ameisensäure (Thermo, Nr. A117-50) gestoppt, bis der pH-Wert 2–3 erreichte.Die Kügelchen wurden dreimal mit 1 ml PBS, enthaltend 0,2 % SDS, dreimal mit 1 ml PBS, enthaltend 1 M Harnstoff, und dann dreimal mit 1 ml destilliertem Wasser gewaschen.Die modifizierten Peptide wurden durch Lichtlyse (365 nm) für 90 min unter Verwendung von 200 &mgr;l 70 % MeOH freigesetzt.Nach Zentrifugation wurde der Überstand gesammelt.Die Kügelchen wurden dann einmal mit 100 &mgr;l 70 % MeOH gewaschen und die Überstände wurden gepoolt.Die Proben wurden in einem Speedvac-Vakuumkonzentrator getrocknet und bis zur Analyse bei –20°C gelagert.
Um Singulett-Sauerstoff-modifizierte Peptide zu identifizieren und zu quantifizieren, wurden Proben in 0,1 % Ameisensäure wieder aufgelöst und 1 μg Peptide wurden mit einem Orbitrap Fusion Lumos Tribrid-Massenspektrometer analysiert, das mit einer Nano-ESI-Quelle von Tune und Xcalibur von Anbietersoftware 4.3 ausgestattet war.Die Proben wurden auf einer 75 µm × 15 cm intern gepackten Kapillarsäule mit 3 µm C18-Material (ReproSil-pur, #r13.b9.) getrennt und an ein EASY-nLC 1200 UHPLC-System (Thermo) angeschlossen.Die Peptide wurden durch lineare 95-Minuten-Gradientenchromatographie von 8 % Lösungsmittel B bis 50 % Lösungsmittel B (A = 0,1 % Ameisensäure in Wasser, B = 0,1 % Ameisensäure in 80 % Acetonitril) getrennt, dann linear auf 98 % B min erhöht in 6 min bei einer Flussrate von 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos sammelt Daten je nach Daten abwechselnd zwischen vollständigem MS-Scan und MS2-Scan.Die Sputterspannung wurde auf 2,1 kV eingestellt und die Temperatur der Ionentransportkapillare betrug 320°C.MS-Spektren (350–2000 m/z) wurden mit einer Auflösung von 120.000, AGC 4 × 105 und einer maximalen Eingabezeit von 150 ms gesammelt.Die 10 häufigsten mehrfach geladenen Vorläufer in jedem vollständigen Scan wurden unter Verwendung von HCD mit einer normalisierten Kollisionsenergie von 30 %, einem Quadrupol-Isolationsfenster von 1,6 m/z und einer Auflösungseinstellung von 30.000 fragmentiert.Ein AGC-Target für die Tandem-Massenspektrometrie mit 5 × 10 4 und einer maximalen Eingangszeit von 150 ms.Die dynamische Ausnahme ist auf 30 Sekunden festgelegt. Nicht zugeordnete Ionen oder solche mit einer Ladung von 1+ und >7+ wurden für MS/MS verworfen. Nicht zugeordnete Ionen oder solche mit einer Ladung von 1+ und >7+ wurden für MS/MS verworfen. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Nicht zugeordnete Ionen oder Ionen mit einer Ladung von 1+ und >7+ wurden für MS/MS verworfen.1+ und mehr als 7+ MS/MS.1+ und mehr als 7+ MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Nicht spezifizierte Ionen oder Ionen mit Ladungen von 1+ und >7+ wurden für MS/MS zurückgewiesen.
Die Verarbeitung der Rohdaten erfolgt mit der Computerplattform FragPipe auf Basis von MSFragger.Massenabweichungen und entsprechende Aminosäuren wurden unter Verwendung eines offenen Suchalgorithmus mit einer Vorläufer-Massentoleranz von –150 bis 500 Da bestimmt.Modifizierte Peptide wurden dann unter Verwendung von Histidin-Modifikationen mit Massengewinnen von +229,0964 und +247,1069 Da in PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo) identifiziert.
Zellen, die das fusionierte miniSOG-Gen stabil exprimieren, wurden in 6-cm-Schalen plattiert.Nach Erreichen von ~80 % Konfluenz wurden die Zellen einmal mit HBSS (Gibco, Nr. 14025092) gewaschen, dann mit chemischen Sonden in HBSS für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert und mit blauem Licht beleuchtet.10 W LED für 20 Minuten bei Raumtemperatur.Um zu bestimmen, welche Art von reaktiven Sauerstoffspezies an PDPL beteiligt ist, 0,5 mM Vitamin C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0). 100 mM Mannit (Energy Chemical, Nr. 69-65-8), 100 μM H 2 O 2 , 10 mM NaN 3 wurden den Zellen als Ergänzungen zugesetzt.Nach dem Waschen mit kaltem PBS wurden die Zellen abgekratzt, in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt und mit einer Spitze für 1 min in 200 μl PBS mit 1 × Proteaseinhibitor ohne EDTA (1 s und 1 s ohne, Amplitude 35 %) beschallt.Die resultierende Mischung wurde bei 15.871 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert und die Überstandskonzentration wurde unter Verwendung eines BCA-Protein-Assay-Kits auf 1 mg/ml eingestellt.Ungefähr 50 &mgr;l des obigen Lysats wurden mit 0,1 mM Rhodaminazid (Aladdin, Nr. T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA-Ligand und 1 mM CuSO 4 für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Rotation von unten nach oben inkubiert.Nach der Click-Reaktion wurde eine Präzipitation mit Aceton durchgeführt, indem den Proben 250 &mgr;l vorgekühltes Aceton zugesetzt, 20 min bei –20°C inkubiert und 10 min bei 6010 × g bei 4°C zentrifugiert wurde.Sammeln Sie das Pellet und kochen Sie es in 50 ul 1x Laemmli-Puffer für 10 min bei 95 °C.Die Proben wurden dann auf langen SDS-PAGE-Gelen analysiert und unter Verwendung des Imaging-Systems Bio-rad ChemiDoc MP Touch mit der Software Image Lab Touch visualisiert.
Die Expression und Reinigung des rekombinanten miniSOG-6xHis-Proteins wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt.Kurz gesagt wurden E. coli BL21(DE3)-Zellen (TransGen, #CD701-02) mit pET21a-miniSOG-6xHis transformiert und die Proteinexpression wurde mit 0,5 mM IPTG (Sangon, #A600168) induziert.Nach der Zelllyse wurden die Proteine ​​unter Verwendung von Ni-NTA-Agaroseperlen (MCE, Nr. 70666) gereinigt, gegen PBS dialysiert und bei –80 °C gelagert.
Mischen Sie für einen Antikörper-basierten In-vitro-Label-Proximity-Assay 100 μM gereinigtes miniSOG, 1 mM Sonde 3 und 1 μg Anti-Label-Maus-monoklonaler Antikörper (TransGen, #HT501-01) in PBS auf ein Gesamtreaktionsvolumen von 50 μl..Das Reaktionsgemisch wurde mit blauem LED-Licht für 0, 2, 5, 10 und 20 min bei Raumtemperatur bestrahlt.Das Gemisch wurde mit 0,1 mM Biotin-PEG3-Azid (Aladdin, Nr. B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA-Ligand und 1 mM CuSO 4 für 1 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttler mit Aufwärtsbewegung inkubiert.Nach einer Schnellreaktion 4x Lämmli-Puffer direkt zur Mischung geben und 10 min bei 95°C kochen.Die Proben wurden auf SDS-PAGE-Gelen analysiert und durch Western-Blotting mit Streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068) analysiert.
Ein histidinhaltiges synthetisches Peptid mit C-terminaler Amidierung (LHDALDAK-CONH2) wurde verwendet, um die in der Nähe befindliche Peptid-basierte In-vitro-Markierung zu analysieren.In diesem Assay wurden 100 &mgr;M gereinigtes miniSOG, 10 mM Sonde 3 und 2 &mgr;g/ml synthetisches Peptid in PBS in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 &mgr;l gemischt.Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur mit blauem LED-Licht bestrahlt.Ein Mikroliter der Probe wurde unter Verwendung eines LC-MS-Systems (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight-Massenspektrometer mit MassLynx-Spektrumanalysesoftware) analysiert.
HEK293T-Zellen, die das miniSOG-Fusionsgen stabil exprimieren, wurden in 10-cm-Schalen für Linien mit unterschiedlicher Organellenlokalisierung (Mito, ER, Nucleus) und 15-cm-Schalen für Parkin-miniSOG- und BRD4-miniSOG-Linien ausgesät.Nach Erreichen von ~90 % Konfluenz wurden die Zellen einmal mit HBSS gewaschen, dann mit Sonde 3 in HBSS für 1 Stunde bei 37°C inkubiert und mit einer blauen 10-W-LED bei Raumtemperatur beleuchtet.Für die berührungslose Markierung von Parkin wurden 10 &mgr;M Protonencarbonylcyanid-Träger m-Chlorphenylhydrazon CCCP (Solarbio, Nr. C6700) mit Sonde 3 in HBSS für 1 Stunde bei 37°C zugegeben.Die Zelllyse-, Click-Chemie-, Reduktions- und Alkylierungsschritte waren die gleichen wie oben beschrieben, außer dass 2 mg Lysat hinzugefügt wurden und Biotin-PEG3-Azid in der Click-Reaktion anstelle von photoabbaubarem Biotinazid verwendet wurde.Nach der Anreicherung wurden die Kügelchen dreimal mit 5 ml PBS, enthaltend 0,2 % SDS, dreimal mit 5 ml PBS, enthaltend 1 M Harnstoff, und dreimal mit 5 ml PBS gewaschen.Danach wurden 2 &mgr;g Trypsin zu 300 &mgr;l 25 mM ABC, enthaltend 1 M Harnstoff, zugegeben, um das Protein über Nacht bei 37°C zu spalten.Die Reaktion wurde durch Zugabe von Ameisensäure gestoppt, bis ein pH-Wert von 2-3 erreicht war.Nach der Trypsinisierung auf Kügelchen wurde die Peptidlösung unter Verwendung einer SOLAμ HRP-Säule (Thermo, Nr. 60209-001) entsalzt und in einem Speedvac-Vakuumkonzentrator getrocknet.Die Peptide wurden in 0,1 % Ameisensäure wieder aufgelöst und 500 ng der Peptide wurden unter Verwendung eines Massenspektrometers Orbitrap Fusion Lumos Tribrid analysiert, das mit der oben beschriebenen Nano-ESI-Quelle ausgestattet war.Peptide wurden auf kommerziellen RP-HPLC-Vorsäulen (75 μm x 2 cm) (Thermo, Nr. 164946) und analytischen RP-HPLC-Säulen (75 μm x 25 cm) (Thermo, Nr. 164941), beide gefüllt mit 2 μm, getrennt.Gradient von 8 % auf 35 % ACN in 60 Minuten, dann linear erhöht auf 98 % B in 6 Minuten bei einer Flussrate von 300 Nl/min.MS-Spektren (350–1500 m/z) wurden mit einer Auflösung von 60.000, AGC 4 × 105 und einer maximalen Eingabezeit von 50 ms aufgenommen.Ausgewählte Ionen wurden sequentiell durch HCD in 3-s-Zyklen mit einer normalisierten Kollisionsenergie von 30 %, einem Quadrupol-Isolationsfenster von 1,6 m/z und einer Auflösung von 15000 fragmentiert. Ein 5 × 104-Tandem-Massenspektrometer-AGC-Target und eine maximale Injektionszeit von 22 ms verwendet.Der dynamische Ausschluss ist auf 45 Sekunden eingestellt. Nicht zugeordnete Ionen oder solche mit einer Ladung von 1+ und >7+ wurden für MS/MS verworfen. Nicht zugeordnete Ionen oder solche mit einer Ladung von 1+ und >7+ wurden für MS/MS verworfen. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Nicht zugeordnete Ionen oder Ionen mit einer Ladung von 1+ und >7+ wurden für MS/MS verworfen.1+ und mehr als 7+ MS/MS.1+ und mehr als 7+ MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Nicht spezifizierte Ionen oder Ionen mit Ladungen von 1+ und >7+ wurden für MS/MS zurückgewiesen.
Die Probenvorbereitungsschritte bis zur Anreicherung der NeutrAvidin-Beads waren die gleichen wie bei der oben beschriebenen LC-MS/MS-Analyse.Ungefähr 50 &mgr;g Lysat wurden als Input für die Ladekontrolle verwendet und 2 mg Lysat wurden für Click-Reaktionen verwendet.Nach Anreicherung und Waschen mit Neutravidin wurden die gebundenen Proteine ​​durch Zugabe von 50 &mgr;l Laemmli-Puffer zu den Agarose-Harzkügelchen und Kochen bei 95°C für 5 Minuten eluiert.Kontrollladungseingabe und mit Kügelchen angereicherte Proben wurden durch SDS-PAGE analysiert und durch Standard-Western-Blot-Verfahren auf PVDF-Membranen (Millipore, #ISEQ00010) übertragen.Die Membranen wurden mit 5 % Magermilch (Sangon, Nr. A600669) in TBS, enthaltend 0,1 % Tween-20 (TBST), blockiert und nacheinander mit primären und sekundären Antikörpern inkubiert.Primäre Antikörper wurden 1:1000 in 5% Magermilch in TBST verdünnt und über Nacht bei 4°C inkubiert.Sekundärantikörper wurden im Verhältnis 1:5000 eingesetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.Die Membranen wurden durch Chemilumineszenz unter Verwendung des Chemidoc MP-Bildgebungssystems sichtbar gemacht.Alle ungeschnittenen Scans von Blots und Gelen in der Abbildung sind als Rohdaten dargestellt.
Primäre Antikörper, die in dieser Studie verwendet wurden, umfassten monoklonale Kaninchen-anti-SFPQ-Antikörper (CST, Nr. 71992), Kaninchen-anti-FUS-monoklonale Antikörper (CST, Nr. 67840), polyklonale Kaninchen-anti-NSUN2-Antikörper (Proteintech, Nr. 20854-1- AP), polyklonaler Kaninchen-anti-mSin3A-Antikörper (Abcam, #ab3479), monoklonaler Maus-anti-Tag-Antikörper (TransGen, #HT201-02), monoklonaler Maus-anti-β-Actin-Antikörper (TransGen, #HC201-01), Kaninchen-anti -Monoklonaler Antikörper CDK2 (ABclonal, #A0094), monoklonaler Kaninchen-Antikörper gegen CTBP1 (ABclonal, #A11600), polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen DUT (ABclonal, #A2901), polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen PSMC4 (ABclonal, #A2505), Kaninchen-Anti- Polyklonaler DNAJB1-Antikörper (ABclonal, # A5504).Diese Antikörper wurden in einer Verdünnung von 1:1000 in 5 % Magermilch in TBST verwendet.Die in dieser Studie verwendeten sekundären Antikörper umfassten Anti-Kaninchen-IgG (TransGen, #HS101-01), Anti-Maus-IgG (TransGen, #HS201-01) in einer Verdünnung von 1:5000.
Um weiter zu untersuchen, ob BRD4 mit SFPQ interagiert, wurden stabile HEK293T- und BRD4-miniSOG-Zellen, die HEK293T überexprimieren, in 10-cm-Schalen ausplattiert.Die Zellen wurden mit kaltem PBS gewaschen und in 1 ml Pierce IP-Lysepuffer (Thermo Fisher, Nr. 87787) mit EDTA-freiem Proteaseinhibitor für 30 Minuten bei 4°C lysiert.Danach wurden die Lysate in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt und bei 15.871 × g für 10 min bei 4°C zentrifugiert.Der Überstand wurde geerntet und mit 5 &mgr;g Anti-V5-markiertem monoklonalem Maus-Antikörper (CST, #80076) über Nacht bei 4°C inkubiert.Waschen Sie ungefähr 50 ul Protein A/G-Magnetperlen (MCE, #HY-K0202) zweimal mit PBS, das 0,5 % Tween-20 enthält.Dann wurden die Zelllysate mit magnetischen Beads für 4 Stunden bei 4°C unter Rotation von unten nach oben inkubiert.Dann wurden die Kügelchen viermal mit 1 ml PBST-Puffer gewaschen und 5 min lang bei 95°C gekocht.Die Proben wurden auf SDS-PAGE-Gelen analysiert und unter Verwendung von Standard-Western-Blot-Verfahren auf PVDF-Membranen übertragen.Die Membranen wurden in 5 % Magermilch in TBST blockiert und nacheinander mit primären und sekundären Antikörpern inkubiert.Primärer Antikörper Monoklonaler Kaninchen-anti-SFPQ-Antikörper (CST, Nr. 71992) wurde in einem Verhältnis von 1:1000 in 5 % Magermilch in TBST verwendet und über Nacht bei 4 °C inkubiert.Anti-Kaninchen-IgG wurde in einem Verhältnis von 1:5000 verwendet und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.Die Membranen wurden durch Chemilumineszenz unter Verwendung des Chemidoc MP-Bildgebungssystems sichtbar gemacht.
Alle für die Solvent Accessible Surface Area (SASA)-Analyse verwendeten Strukturen stammen aus der Protein Data Bank (PDB)52 oder der AlphaFold Protein Structure Database53.Die absolute SASA wurde für jeden Rückstand unter Verwendung des FreeSASA-Programms berechnet.Nur vollständige und eindeutige SASA-Daten für markiertes Histidin und seine Nachbarn wurden verwendet, um die mittlere SASA für jede Struktur zu erhalten.Die relative Lösungsmittelzugänglichkeit (RSA) für jedes Histidin wurde berechnet, indem der absolute SASA-Wert durch die empirisch maximal mögliche Rückstandsoberfläche dividiert wurde, die dem Lösungsmittel zur Verfügung steht.Alle Histidine wurden dann als versteckt eingestuft, wenn der mittlere RSA-Wert unter 20 % lag, andernfalls exponiert56.
Im DDA-Modus erhaltene Rohdateien wurden mit Proteome Discoverer (v2.5) oder MSfragger (Fragpipe v15.0) in der entsprechenden von SwissProt verifizierten Proteindatenbank mit häufigen Kontaminanten durchsucht.Die Peptide erforderten vollständiges Trypsin mit zwei fehlenden Spaltstellen, Carbamoyl-Methylierung als feste Modifikation und Methionin-Oxidation als dynamische Modifikation.Die Gewichtstoleranzen für Vorläufer und Fragmente wurden auf 10 ppm bzw. 0,02 Da (MS2 Orbitrap) eingestellt. Verunreinigungstreffer wurden entfernt und Proteine ​​wurden gefiltert, um eine Falschentdeckungsrate von <1 % zu erhalten. Verunreinigungstreffer wurden entfernt und Proteine ​​wurden gefiltert, um eine Falschentdeckungsrate von <1 % zu erhalten. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент лож. Kontaminierungstreffer wurden entfernt und Proteine ​​gefiltert, um eine falsche Erkennungsrate von < 1 % zu ergeben.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1 % der Antworten. <1%. Kontaminierungstreffer wurden entfernt und Proteine ​​gefiltert, um eine Falsch-Positiv-Rate von <1 % zu erreichen.Für die quantitative Analyse ohne die Verwendung von Markierungen wurde der normalisierte Proteingehalt von drei biologischen Wiederholungen verwendet.Die subzelluläre Proteinlokalisierungsanalyse wurde unter Verwendung der Gene Ontology (GO)-Analyse von DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 und Datenbanken durchgeführt, die von der Alice Ting-Gruppe zusammengestellt und veröffentlicht wurden.Die Vulkankarte wurde von Perseus (v1.6.15.0) bezogen. Proteinhäufigkeitsfaltenänderungen wurden unter Verwendung eines zweiseitigen t-Tests auf statistische Signifikanz getestet, und Proteintreffer wurden mit einer Häufigkeitsänderung > 2 (sofern nicht anders angegeben) und einem p-Wert < 0,05 identifiziert. Proteinhäufigkeitsfaltenänderungen wurden unter Verwendung eines zweiseitigen t-Tests auf statistische Signifikanz getestet, und Proteintreffer wurden mit einer Häufigkeitsänderung > 2 (sofern nicht anders angegeben) und einem p-Wert < 0,05 identifiziert. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Proteingehaltsfaltungsänderungen wurden unter Verwendung eines zweiseitigen t-Tests auf statistische Signifikanz getestet, und Proteinübereinstimmungen wurden mit einer Gehaltsänderung > 2 (sofern nicht anders angegeben) und einem p-Wert < 0,05 identifiziert.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （除非 有 说明 和 值 p 值 <0,05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （有 说明） p 值 <0,05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Die statistische Signifikanz der fachen Änderungen des Proteingehalts wurde unter Verwendung eines zweiseitigen t-Tests getestet, und Proteinübereinstimmungen wurden für Gehaltsänderungen > 2 (sofern nicht anders angegeben) und p-Werte < 0,05 bestimmt.Die Proteininteraktionsanalyse wurde unter Verwendung der GO-Analyse zusammen mit der String-Datenbank durchgeführt.
Drei biologische Wiederholungen wurden mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism (GraphPad-Software) durchgeführt und Vulkandiagramme wurden mit Perseus (v1.6.15.0) erstellt.Um die beiden Gruppen zu vergleichen, wurden p-Werte unter Verwendung eines zweiseitigen Student-t-Tests bestimmt.In die Vulkanplots wurden nur Singleton-Proteine ​​aufgenommen, die mindestens zweimal in der Versuchsgruppe identifiziert wurden, und die entsprechenden fehlenden Werte in der Kontrollgruppe wurden durch Perseus aus einer Normalverteilung ersetzt, damit der p-Wert berechnet werden konnte.Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar.Bei proteomischen Analysen zur statistischen Analyse wurde die Häufigkeit von Proteinen, die in mindestens zwei biologischen Wiederholungen auftraten, beibehalten.Statistische Methoden wurden nicht verwendet, um die Stichprobengröße im Voraus zu bestimmen.Die Experimente sind nicht zufällig.Während des Experiments und der Auswertung der Ergebnisse waren die Forscher den Aufgaben gegenüber nicht blind.
Weitere Informationen zum Studiendesign finden Sie in der Zusammenfassung des Nature Research Report, die mit diesem Artikel verlinkt ist.
Die in dieser Studie gewonnenen Massenspektrometriedaten wurden über das iProX57-Partnerrepository unter der Datensatz-ID PXD034811 (PDPL-MS-Datensatz) an das ProteomeXchange-Konsortium übermittelt.Rohdaten werden in Form von Rohdatendateien bereitgestellt.Dieser Artikel enthält die Originaldaten.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Kennenlernen der Nachbarschaft: Verwendung von Nähe-abhängiger Biotinylierung zur Charakterisierung von Proteinkomplexen und Kartierung von Organellen. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Kennenlernen der Nachbarschaft: Verwendung von Nähe-abhängiger Biotinylierung zur Charakterisierung von Proteinkomplexen und Kartierung von Organellen.Gingras, AS, Abe, KT und Raut, B. Vertrautheit mit der Umgebung: Verwendung von Nähe-abhängiger Biotinylierung zur Charakterisierung von Proteinkomplexen und Kartierung von Organellen. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Die Nachbarschaft verstehen: Nutzen Sie die Abhängigkeit der Nachbarschaft von biologischem Leben.Gingras, AS, Abe, KT und Raut, B. Nähe verstehen: Charakterisierung von Proteinkomplexen und Kartierung von Organellen mithilfe von Nähe-abhängiger Biotinylierung.Aktuell.Meine Meinung.Chemisch.Biologie 48, 44–54 (2019).
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