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Herkömmliche diagnostische Strategien zum Nachweis von Infektionskrankheiten erfordern den Einsatz von Tischgeräten, die für Point-of-Care-Tests (POCT) nicht geeignet sind.Die aufkommende Mikrofluidik ist eine stark miniaturisierte, automatisierte und integrierte Technologie, die eine potenzielle Alternative zu herkömmlichen Methoden für eine schnelle, kostengünstige und genaue Vor-Ort-Diagnostik darstellt.Molekulardiagnostische Verfahren werden in mikrofluidischen Geräten häufig als die effektivsten Methoden zum Nachweis von Krankheitserregern eingesetzt.Dieser Aufsatz fasst die jüngsten Fortschritte in der mikrofluidikbasierten Molekulardiagnostik von Infektionskrankheiten sowohl aus akademischer als auch aus industrieller Sicht zusammen.Zunächst beschreiben wir eine typische On-Chip-Verarbeitung von Nukleinsäuren, einschließlich Probenvorbehandlung, Amplifikation und Signalablesung.Anschließend werden die Eigenschaften, Vor- und Nachteile der vier Arten von mikrofluidischen Plattformen verglichen.Als nächstes werden wir die Verwendung digitaler Assays für die absolute Quantifizierung von Nukleinsäuren erörtern.Sowohl klassische als auch neuere kommerzielle Mikrofluidik-basierte Molekulardiagnostikgeräte werden als Beleg für die aktuelle Marktlage zusammengefasst.Schließlich schlagen wir zukünftige Richtungen für die mikrofluidische Diagnose von Infektionskrankheiten vor.
Infektionskrankheiten werden durch Krankheitserreger verursacht, darunter Bakterien, Viren und Parasiten, die auf der ganzen Welt verbreitet sind.Im Gegensatz zu anderen Krankheiten infizieren sich Krankheitserreger schnell und breiten sich durch Inokulation, Luft und Wassermedien zwischen Menschen und Wirtstieren aus [1].Die Prävention von Infektionskrankheiten ist als Maßnahme der öffentlichen Gesundheit von entscheidender Bedeutung.Drei Hauptstrategien zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten: (1) Bekämpfung der Infektionsquelle;(2) Unterbrechung des Übertragungswegs;(3) Schutz anfälliger Populationen.Unter den Hauptstrategien wird die Kontrolle der Infektionsquelle aufgrund ihrer Bequemlichkeit und geringen Kosten als die wichtigste Strategie angesehen.Eine schnelle Diagnose, Isolierung und Behandlung infizierter Personen ist von entscheidender Bedeutung und erfordert schnelle, sensible und genaue diagnostische Strategien [2].Die aktuelle Diagnose von Infektionskrankheiten kombiniert in der Regel eine klinische Untersuchung auf der Grundlage von Anzeichen und Symptomen und Laboruntersuchungen wie Zellkultur und molekulare Diagnostik, die geschultes Personal, arbeitsintensive Verfahren und teure Testgeräte erfordern [3, 4].Die Prävention des Ausbruchs von Infektionskrankheiten erfordert eine schnelle, kostengünstige und genaue lokale Diagnose, insbesondere in Gebieten mit begrenzten Ressourcen, in denen Infektionskrankheiten häufig und schwerwiegend sind [5], sowie eine Behandlung in der Wildnis oder auf dem Schlachtfeld, wo Notfälle unvorhersehbar sind..Die medizinische Versorgung ist begrenzt [6].In diesem Zusammenhang ist Mikrofluidik eine Technologie, die mikroelektromechanische Systemtechnologien, Nanotechnologie oder Materialwissenschaften zur präzisen Fluidmanipulation kombiniert [7,8,9,10] und neue Möglichkeiten für die Point-of-Care-Erkennung (POCT) bietet.) Infektionserreger außerhalb von Krankenhäusern und Labors.Im Vergleich zur herkömmlichen zeitaufwändigen Diagnostik bietet die Mikrofluidik-Technologie Proben- und Kosteneinsparungen für die Molekulardiagnostik bei Krankheitsausbrüchen.Die weltweite Ausbreitung der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) wird durch das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursacht, sodass die Bedeutung der Mikrofluidik für die rechtzeitige Prävention und Bekämpfung der Pandemie erneut betont wird [11, 12 , 13].Im Gegensatz zur herkömmlichen Diagnostik verwendet die mikrofluidische POCT kleine tragbare Geräte, die von Benchtop-Analysatoren bis hin zu kleinen Nebenstrom-Teststreifen reichen, um in der Nähe der Probenahmestelle zu testen [14].Diese Tests zeichnen sich durch einfache oder keine Probenvorbereitung, schnelle Signalverstärkung und empfindliche Signalmessungen aus, was zu einer kurzen Dauer und genauen Ergebnissen innerhalb von Minuten führt.Die Verfügbarkeit und Massenproduktion von mikrofluidischen Gesundheitsinstrumenten haben ihre kostengünstigen und direkten diagnostischen Anwendungen außerhalb des Krankenhauses, in der Nähe des Patienten und sogar zu Hause erweitert.
Unter den bestehenden Strategien zur Diagnostik von Infektionskrankheiten ist die Molekulardiagnostik eine der sensibelsten [15, 16].Darüber hinaus wird die molekulare Diagnostik häufig als Goldstandard für den kontinuierlichen Nachweis von COVID-19 verwendet, der den direkten Nachweis virusspezifischer Regionen von RNA oder DNA vor dem Einsetzen einer Immunantwort ermöglicht [17, 18].In der aktuellen Übersicht präsentieren wir die neuesten Fortschritte in mikrofluidikbasierten molekulardiagnostischen Verfahren für Infektionskrankheiten aus akademischer Perspektive bis hin zu zukünftigen industriellen Perspektiven (Abb. 1).Wir beginnen mit drei Schlüsselschritten beim Nukleinsäurenachweis: On-Chip-Probenvorbehandlung, Nukleinsäureamplifikation und Signalablesung.Anschließend verglichen wir verschiedene Arten von mikrofluidischen Plattformen mit ihrer Struktur und Funktion und zeigten einzigartige Eigenschaften (Stärken und Schwächen).Der digitale Nukleinsäurenachweis wird weiter diskutiert und als Beispiel für eine Technologie der dritten Generation zur absoluten Quantifizierung infektiöser Pathogenmoleküle angeführt.Darüber hinaus werden einige typische und neueste kommerzielle POCT-Geräte präsentiert, um den aktuellen Stand des mikrofluidischen POCT-Marktes für die Molekulardiagnostik zu demonstrieren.Wir werden auch unsere Vision für zukünftige Anwendungen diskutieren und erläutern.
Module mikrofluidischer Chips zur Nukleinsäuredetektion können entsprechend ihrer Funktionen in drei Kategorien (Sampling, Recognition, Signaling) eingeteilt werden [19].Unter diesen Modulen realisiert das Probenahmemodul hauptsächlich die Probenlyse und die Nukleinsäureextraktion.Das Sensormodul steuert hauptsächlich die Umwandlung und Verstärkung von Nukleinsäuresignalen.Das Signalisierungsmodul erfasst das Signal, das von dem Erfassungsmodul umgewandelt und verarbeitet wird.Basierend auf dem Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren auf einem Chip werden wir die verschiedenen Chips zusammenfassen, die die Funktion „Eingabe und Ausgabe“ realisieren können.
Der erste Schritt beim Nukleinsäurenachweis ist die Nukleinsäureextraktion, dh die Isolierung der Zielnukleinsäure aus der ursprünglichen Probe.Die Nukleinsäureextraktion wird durchgeführt, um Nukleinsäuren von anderen molekularen Verunreinigungen zu reinigen, die Integrität der Primärstruktur von Nukleinsäuremolekülen sicherzustellen und die Ergebnisse zu optimieren.Die Nukleinsäureextraktion erfordert die notwendige Probenlyse und Nukleinsäureerfassung, deren Qualität und Effizienz einen großen Einfluss auf Forschungs- und Diagnoseergebnisse haben.Alle subtilen Nebenwirkungen während der Extraktion können die weitere Erkennung einschränken.Beispielsweise werden Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Schleifen-Isotherm-Amplifikation (LAMP)-Methoden durch einige restliche organische Lösungsmittel wie Ethanol und Isopropanol in Nukleinsäure-Isolierungsreagenzien gehemmt [20].Flüssig-Flüssig-Extraktion und Festphasenextraktion sind die beliebtesten Methoden zur Isolierung von Nukleinsäuren [21], jedoch ist die Flüssig-Flüssig-Extraktion auf einem Chip äußerst begrenzt, da die bei der Flüssig-Flüssig-Extraktion verwendeten Reagenzien eine Korrosion der meisten mikrofluidischen Chips verursachen .Hier stellen wir Microarray-basierte Festphasenextraktionsmethoden vor und vergleichen ihre Vor- und Nachteile.
Silizium ist aufgrund seiner Biokompatibilität, Stabilität und einfachen Modifikation ein mit Nukleinsäuren kompatibles Substratmaterial [22].Wichtig ist, dass dieses Komposit, wenn es mit Silica oder anderen Materialien modifiziert wird, Eigenschaften aufweist, um negativ geladene Nukleinsäuren unter Bedingungen mit niedrigem pH-Wert und hohem Salzgehalt zu adsorbieren, während es mit Lösungen mit hohem pH-Wert und niedrigem Salzgehalt eluiert.Basierend auf diesem Phänomen ist es möglich, die Nukleinsäure zu reinigen.
Für die Nukleinsäureextraktion in der Mikrofluidik wurden verschiedene Formen von Materialien auf Silicabasis verwendet, wie z. B. Silicaperlen, Pulver, Mikrofaserfilter und Silicamembranen [23, 24, 25, 26].Je nach Materialeigenschaften können siliziumbasierte Materialien in Mikroschaltungen auf unterschiedliche Weise eingesetzt werden.Beispielsweise können Silica-Granulate, -Pulver und kommerzielle Nanofilter einfach in die Poren oder Mikrokanäle von Mikrofluidik-Chips eingebracht werden und helfen, Nukleinsäuren aus Proben zu extrahieren [27, 28, 29].Oberflächenmodifizierte Silica-Membranen können auch verwendet werden, um DNA schnell und kostengünstig von Krankheitserregern zu reinigen.Wang et al.[30] Durch die Kombination von denaturierenden Amplifikationsreaktionen mit Vesikel-vermitteltem Kettenaustausch mit Silikamembranen, die mit Chitosan-Oligosacchariden beschichtet sind, wurde ein vielseitiges tragbares System eingeführt, das erfolgreich 102–108 koloniebildende Einheiten detektierte.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., und das Vorhandensein des Virus war leicht sichtbar.Powellet al.[31] Mikroarrays auf Siliziumbasis wurden dann verwendet, um das Hepatitis-C-Virus (HCV), das humane Immundefizienzvirus (HIV), das Zika-Virus und das humane Papillomavirus sowie die automatische Vermehrung nachzuweisen, wobei ein 1,3-μl-Mikroreaktor zum Einfangen von RNA-Viren entwickelt wurde.und eine In-situ-Amplifikation durchführen.Neben diesen Methoden spielen auch oberflächenmodifizierte Silica-Mikrosäulen eine Schlüsselrolle bei der Nukleinsäureextraktion, da die Geometrie und die Eigenschaften des modifizierenden Materials die Extraktionseffizienz stark erhöhen.Chenet al.[32] schlugen eine mikrofluidische Plattform zur Isolierung von RNA in niedriger Konzentration vor, die auf aminobeschichteten Siliziummikrosäulen basiert.Dieses mikrofluidische Gerät integriert eine Anordnung von 0,25 cm2 großen Mikrosäulen auf einem Siliziumsubstrat, um eine höhere Extraktionseffizienz durch ein Design mit hohem Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis zu erreichen.Der Vorteil dieses Designs besteht darin, dass das mikrofluidische Gerät eine Nukleinsäureextraktionseffizienz von bis zu 95 % erreichen kann.Diese siliziumbasierten Strategien demonstrieren den Wert der schnellen und kostengünstigen Isolierung von Nukleinsäuren.In Kombination mit mikrofluidischen Chips können siliziumbasierte Extraktionsstrategien nicht nur die Effizienz des Nukleinsäurenachweises steigern, sondern auch die Miniaturisierung und Integration von Analysegeräten erleichtern [20].
Magnetische Trennverfahren verwenden magnetische Partikel, um Nukleinsäuren in Gegenwart eines externen Magnetfelds zu isolieren.Häufig verwendete magnetische Partikel umfassen magnetische Fe3O4- oder γ-Fe2O3-Magnetpartikel, die mit Silica, Amino und Carboxyl beschichtet sind [33,34,35,36].Das Unterscheidungsmerkmal von Magnetpartikeln im Vergleich zu siliziumbasierten SPE-Methoden ist die einfache Manipulation und Kontrolle mit externen Magneten.
Unter Verwendung der elektrostatischen Wechselwirkung zwischen Nukleinsäuren und Kieselsäure werden unter Bedingungen mit hohem Salzgehalt und niedrigem pH-Wert Nukleinsäuren auf der Oberfläche von mit Kieselsäure beschichteten Magnetpartikeln adsorbiert, während unter Bedingungen mit niedrigem Salzgehalt und hohem pH-Wert die Moleküle gewaschen werden können wieder..Mit Silica beschichtete Magnet-Beads ermöglichen die Extraktion von DNA aus großvolumigen Proben (400 μl) durch magnetisch kontrollierte Bewegung [37].Zur Demonstration haben Rodriguez-Mateos et al.[38] verwendeten abstimmbare Magnete, um den Transfer von Magnetkügelchen zu verschiedenen Kammern zu steuern.Basierend auf Silica-beschichteten Magnetpartikeln können 470 Kopien/ml genomischer SARS-CoV-2-RNA aus Abwasserproben für den LAMP-Reverse-Transkriptions-Nachweis (RT-LAMP) extrahiert und die Antwort innerhalb von 1 Stunde abgelesen werden.bloßem Auge (Abb. 2a).
Geräte basierend auf magnetischen und porösen Materialien.Konzeptdiagramm des mikrofluidischen IFAST RT-LAMP-Geräts für den SARS-CoV-2-RNA-Nachweis (adaptiert von [38]).b Zentrifugalmikrogerät für die dSPE von Nukleinsäure aus Wangenabstrichen (adaptiert nach [39]).c Eingebauter Probenkonzentrator mit eigener Stromversorgung unter Verwendung einer FTA®-Karte (adaptiert von [50]).d Fusion 5-Filterpapier, modifiziert mit Chitosan (nach [51]).SARS-CoV-2 schweres akutes Atemwegssyndrom Coronavirus 2, RT-LAMP-Reverse-Transkriptionsschleife vermittelte isotherme Amplifikation, FTA-Finder-Technologiepartner, NA-Nukleinsäure
Positiv geladene magnetische Partikel sind ideal, um das Phosphatrückgrat einer Nukleinsäure anzuheften.Bei einer bestimmten Salzkonzentration können die negativ geladenen Phosphatgruppen von Nukleinsäuren auf der Oberfläche der magnetischen Kompositpartikel positiv geladen werden.Daher wurden magnetische Nanopartikel mit einer rauen Oberfläche und einer hohen Dichte an Aminogruppen für die Extraktion von Nukleinsäuren entwickelt.Nach magnetischer Trennung und Blockierung können magnetische Nanopartikel und DNA-Komplexe direkt in der PCR verwendet werden, wodurch komplexe und zeitaufwändige Reinigungs- und Elutionsoperationen entfallen [35].Mit negativen Carboxylgruppen beschichtete magnetische Nanopartikel wurden auch verwendet, um Nukleinsäuren zu trennen, die auf Oberflächen in hochkonzentrierten Polyethylenglycol- und Natriumchloridlösungen adsorbiert wurden [36].Mit diesen oberflächenmodifizierten Magnet-Beads ist die DNA-Extraktion mit der anschließenden Amplifikation kompatibel.Dignanet al.[39] beschrieb eine automatisierte und tragbare zentrifugale mikrofluidische Plattform für die Nukleinsäurevorbehandlung, die es nicht-technischem Personal ermöglicht, sie vor Ort zu verwenden.Darüber hinaus demonstriert die Kompatibilität der isolierten DNA mit LAMP, einer Methode, die sich gut für die Point-of-Care-Nukleinsäureanalyse eignet, die minimalen Ausrüstungsanforderungen und die Eignung für kolorimetrische Assays (Abb. 2b).
Magnetbead-Verfahren bieten die Möglichkeit der automatisierten Extraktion, von denen einige in kommerziellen automatisierten Nukleinsäure-Extraktoren existieren [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, USA), QIAcube® HT;CapitalBio (Peking, China) und Biomek®;Beckmann (Miami, USA).), Florida, USA)].Die Vorteile der Kombination von magnetischen Beads mit Mikrofluidik können für eine effiziente automatisierte Extraktion von Nukleinsäuren genutzt werden, was möglicherweise die Entwicklung der Molekulardiagnostik vorantreiben könnte;Die Kombination von Magnetkügelchen mit Mikrofluidik ist jedoch immer noch stark auf komplexe Steuersysteme für die präzise Manipulation von Magnetkügelchen angewiesen, was die Popularität von kommerziellen Produkten erklärt, die sperrig und teuer sind, was die weitere Anwendung von Magnetkügelchen in POCT einschränkt.
Mehrere poröse Materialien wie modifizierte Nitrozellulosefilter, Karten von Finders Technology Associates (FTA), Filterpapiere auf Polyethersulfonbasis und glykanbeschichtete Materialien wurden ebenfalls für den Nukleinsäurenachweis verwendet [40, 41, 42, 43, 44].Poröse faserige Materialien wie faseriges Papier wurden zuerst verwendet, um DNA zu isolieren, indem langsträngige DNA-Moleküle physikalisch mit Fasern verschlungen wurden.Kleine Poren führen zu einer starken physikalischen Beschränkung von DNA-Molekülen, was sich positiv auf die DNA-Extraktion auswirkt.Aufgrund der unterschiedlichen Porengrößen von Faserpapier kann die Extraktionseffizienz die Anforderungen der DNA-Amplifikation nicht erfüllen [45, 46].Die FTA-Karte ist ein kommerzielles Filterpapier, das im Bereich der Gerichtsmedizin verwendet wird und in anderen Bereichen der Molekulardiagnostik weit verbreitet ist.Durch die Verwendung von Zellulose-Filterpapier, das mit verschiedenen Chemikalien imprägniert ist, um die Zellmembranen in der Probe zu lysieren, wird die freigesetzte DNA bis zu 2 Jahre vor Abbau geschützt.In jüngerer Zeit wurde imprägniertes Zellulosepapier für den molekularen Nachweis verschiedener Krankheitserreger entwickelt, darunter SARS-CoV-2, Leishmaniose und Malaria [47,48,49].HIV im isolierten Plasma wird direkt lysiert und die virale Nukleinsäure wird in der im Konzentrator eingebauten FTA®-Flussmembran angereichert, was eine effiziente Produktion der Nukleinsäure ermöglicht [50] (Abb. 2c).Das Hauptproblem beim Nukleinsäurenachweis mit FTA-Karten besteht darin, dass Chemikalien wie Guanidin und Isopropanol nachfolgende Amplifikationsreaktionen hemmen.Um dieses Problem zu lösen, haben wir das Chitosan-modifizierte Fusion 5-Filterpapier entwickelt, das die Vorteile sowohl der physikalischen Verflechtung von DNA-Molekülen und faserigem Filterpapier als auch der elektrostatischen Adsorption von DNA auf Chitosan-modifizierten Verbindungen kombiniert, um eine hocheffiziente Nukleinsäureextraktion zu erreichen ..Filterfasern [51] (Abb. 2d).In ähnlicher Weise haben Zhu et al.[52] demonstrierten eine Chitosan-modifizierte PCR-Methode basierend auf einem in situ Kapillarmikrofluidiksystem für die schnelle Isolierung und den Nachweis von Zika-Virus-RNA.Nukleinsäuren können in einem gemischten Lysat/PCR-Medium adsorbiert/desorbiert werden, basierend auf der Ein/Aus-Schalteigenschaft von Chitosan.ein und aus“, reagiert auf den pH-Wert.
Wie oben erwähnt, kombinieren diese Strategien die Vorteile verschiedener Festphasenmaterialien und steigern die Effizienz der Nukleinsäureextraktion in der Mikrofluidik.In praktischen Anwendungen ist die Verwendung dieser Materialien in großen Mengen unwirtschaftlich, und eine geeignete Oberflächenbehandlung oder Oberflächenmodifizierung üblicher Materialien mit diesen Materialien kann auch ihre Funktion bewahren.Daher wird angenommen, dass die Umsetzung dieser Strategien nach einer Pilotstudie die Kosten senken kann.
Nukleinsäuretests auf mikrofluidischen Plattformen verwenden oft kleine Probenvolumina (< 100 µl) und erfordern daher eine Amplifikation der Zielnukleinsäuren mit spezifischen Sonden zur Umwandlung in ein Signal, das für die nachfolgende Detektion (optisch, elektrisch und magnetisch) geeignet ist [53, 54]. Nukleinsäuretests auf mikrofluidischen Plattformen verwenden oft kleine Probenvolumina (< 100 µl) und erfordern daher eine Amplifikation der Zielnukleinsäuren mit spezifischen Sonden zur Umwandlung in ein Signal, das für die nachfolgende Detektion (optisch, elektrisch und magnetisch) geeignet ist [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Beim Testen von Nukleinsäuren auf mikrofluidischen Plattformen werden häufig kleine Probenvolumina (<100 µl) verwendet, sodass die Amplifikation von Zielnukleinsäuren mit speziellen Sonden erforderlich ist, um sie in ein Signal umzuwandeln, das für die nachfolgende Detektion geeignet ist (optisch, elektrisch und magnetisch). [53, 54].微流控 平台 上 的 检测 通常 使用 小样本量 （<100 µl） 因此 需要 使用 特定 探针 扩增 目标 核酸 ， 以 转换 为 下游 检测 （光学 、 电学 和 磁学 的 的 [53, 54 ]。微流控 平台 上 的 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 目标 以 转换 为 下游 下游 光学 、 、 磁学）） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Der Nachweis von Nukleinsäuren auf mikrofluidischen Plattformen verwendet normalerweise kleine Probenvolumina (<100 μl), was eine Amplifikation von Zielnukleinsäuren mit speziellen Sonden erfordert, um sie in Signale für den anschließenden Nachweis umzuwandeln (optisch, elektrisch und magnetisch) [53, 54]] .Nukleinsäureamplifikation in der Mikrofluidik kann auch Reaktionen beschleunigen, Nachweisgrenzen optimieren, Probenanforderungen reduzieren und die Nachweisgenauigkeit verbessern [55, 56].In den letzten Jahren wurden mit der Realisierung eines schnellen und genauen Nachweises verschiedene Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren in der Mikrofluidik angewendet, einschließlich PCR und einiger isothermer Amplifikationsreaktionen.Dieser Abschnitt fasst Methoden zum Nachweis von Nukleinsäuren basierend auf mikrofluidischen Systemen zusammen.
PCR ist eine Simulation des DNA-Replikationsprozesses eines Organismus, dessen Theorie an anderer Stelle ausführlich beschrieben wird und hier nicht diskutiert wird.Die PCR kann eine sehr kleine Menge an Ziel-DNA/RNA exponentiell amplifizieren, was die PCR zu einem leistungsstarken Werkzeug für den schnellen Nachweis von Nukleinsäuren macht.In den letzten Jahrzehnten wurden viele tragbare mikrofluidische Geräte, die mit PCR-Thermocycling-Systemen ausgestattet sind, entwickelt, um die Anforderungen der Point-of-Care-Diagnostik zu erfüllen [57, 58].Die On-Chip-PCR kann nach verschiedenen Temperaturkontrollmethoden in vier Typen (konventionelle, kontinuierliche Durchfluss-, räumlich geschaltete und konvektive PCR) unterteilt werden [59].Zum Beispiel Gee et al.[60] entwickelten auf ihrer eigenen mikrofluidischen Plattform eine quantitative PCR-Methode mit direkter reverser Transkription (RT-qPCR) für den Multiplex-Nachweis von SARS-CoV-2, Influenza-A- und -B-Viren in Rachenabstrichproben (Abb. 3a) .Parket al.[61] bauten einen einfachen Pathogenanalyse-Chip, indem sie Dünnschicht-PCR, Elektroden und ein mit dem Finger bedienbares mikrofluidisches Modul auf Polydimethylsiloxanbasis integrierten.Beide Arbeiten verkörpern jedoch die gemeinsamen Mängel der herkömmlichen PCR.Die PCR erfordert thermische Zyklen, was die weitere Geräteminiaturisierung und die verkürzte Testzeit einschränkt.
Die Entwicklung einer auf kontinuierlichem Fluss basierenden mikrofluidischen und raumgeschalteten PCR ist entscheidend, um dieses Problem anzugehen.Durch die Verwendung eines langen Serpentinenkanals oder eines kurzen geraden Kanals kann die PCR mit kontinuierlichem Fluss eine schnelle Amplifikation durch aktive Zirkulation von Reagenzien in drei Vorheizzonen mit einer Off-Chip-Pumpe ermöglichen.Dieser Vorgang vermeidet erfolgreich die Übergangsphase zwischen unterschiedlichen Reaktionstemperaturen und reduziert somit die Testzeit erheblich [62] (Abb. 3b).In einer weiteren Studie von Jung et al.[63] schlugen einen neuen Rotations-PCR-Genanalysator vor, der die Eigenschaften von Fixed- und Flow-PCR für ultraschnelle und Multiplex-Reverse-Transkriptions-PCR kombiniert (Abb. 3c).Für die Nukleinsäure-Amplifikation wird der PCR-Mikrochip durch drei Heizblöcke bei unterschiedlichen Temperaturen rotiert: 1. Denaturierungsblock 94°C, 2. Annealing-Block bei 58°C, 3. Expansionsblock bei 72°C.
Anwendung der PCR in der Mikrofluidik.Schematische Darstellung der dirRT-qPCR auf einer mikrofluidischen Plattform (nach [60]).b Schematische Darstellung eines Continuous-Flow-PCR-Microarrays basierend auf einem Serpentinenkanal (nach [62]).c Schematische Darstellung eines Rotations-PCR-Genanalysators, bestehend aus einem Mikrochip, drei Heizblöcken und einem Schrittmotor (nach [63]).d Schema einer Thermokonvektions-PCR mit Zentrifugation und Aufbau (nach [64]).DirRT-qPCR, direkte quantitative reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion
Unter Verwendung von Kapillaren und Schleifen oder sogar dünnen Platten kann die Konvektions-PCR Nukleinsäuren durch natürliche freie thermische Konvektion schnell amplifizieren, ohne dass eine externe Pumpe erforderlich ist.Beispielsweise wurde eine mikrofluidische Plattform aus zyklischem Olefinpolymer auf einem hergestellten rotierenden Heiztisch entwickelt, der thermische Zyklen mit Zentrifugation in einem Mikrokanal mit PCR-Schleife verwendet [64] (Abb. 3d).Die Reaktionslösung wird durch thermische Konvektion angetrieben, die in einem Mikrokanal mit einer ringförmigen Struktur kontinuierlich hohe und niedrige Temperaturen austauscht.Der gesamte Amplifikationsprozess kann in 10 Minuten mit einer Nachweisgrenze von 70,5 pg/Kanal abgeschlossen werden.
Wie erwartet, ist die schnelle PCR ein leistungsstarkes Werkzeug für vollständig integrierte molekulardiagnostische und Multiplex-Analysesysteme mit Probenantwort.Rapid PCR reduziert die Zeit, die zum Nachweis von SARS-CoV-2 benötigt wird, erheblich, was zur wirksamen Bekämpfung der COVID-19-Pandemie beiträgt.
Die PCR erfordert einen komplexen Thermocycler, der für POCT nicht geeignet ist.In jüngerer Zeit wurden isotherme Amplifikationstechniken auf die Mikrofluidik angewendet, einschließlich, aber nicht beschränkt auf LAMP, Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) und Amplifikation basierend auf Nukleinsäuresequenzen [65,66,67,68].Mit diesen Techniken werden Nukleinsäuren bei einer konstanten Temperatur amplifiziert, was die Herstellung von kostengünstigen, hochempfindlichen tragbaren POCT-Geräten für die Molekulardiagnostik erleichtert.
Mikrofluidik-basierte LAMP-Assays mit hohem Durchsatz ermöglichen den multiplen Nachweis von Infektionskrankheiten [42, 69, 70, 71].In Kombination mit einem zentrifugalen mikrofluidischen System kann LAMP die Automatisierung des Nukleinsäurenachweises weiter erleichtern [69, 72, 73, 74, 75].Der Spin-and-React-SlipChip wurde für den visuellen Nachweis mehrerer paralleler Bakterien mit LAMP entwickelt [76] (Abb. 4a).Bei Verwendung von optimiertem LAMP im Assay war das Signal-Rausch-Verhältnis der Fluoreszenz ungefähr 5-fach und die Nachweisgrenze erreichte 7,2 Kopien/μl genomischer DNA. Darüber hinaus wurde die Existenz von fünf häufigen bakteriellen Pathogenen des Verdauungstrakts, darunter Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis und Vibrio parahaemolyticus, basierend auf der Methode in < 60 min sichtbar gemacht. Darüber hinaus wurde die Existenz von fünf häufigen bakteriellen Pathogenen des Verdauungstrakts, darunter Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis und Vibrio parahaemolyticus, basierend auf der Methode in < 60 min sichtbar gemacht.Darüber hinaus wurde das Vorhandensein von fünf häufigen bakteriellen Pathogenen des Verdauungstrakts, darunter Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis und Vibrio parahaemolyticus, mit dieser Methode in weniger als 60 Minuten sichtbar gemacht."" HIPDarüber hinaus wurde das Vorhandensein von fünf häufigen bakteriellen gastrointestinalen Pathogenen, darunter Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius und Vibrio parahaemolyticus, mit dieser Methode in weniger als 60 Minuten sichtbar gemacht.
Zu den Vorteilen von LAMP in der Mikrofluidik gehören unter anderem eine schnelle Reaktion und eine miniaturisierte Detektion.Aufgrund der Reaktionstemperatur (ca. 70 °C) werden während der LAMP jedoch zwangsläufig Aerosole erzeugt, was zu einer hohen Falsch-Positiv-Rate führt.Assay-Spezifität, Primer-Design und Temperaturkontrolle müssen ebenfalls für LAMP optimiert werden.Darüber hinaus sind Chipdesigns, die eine mehrfache Zieldetektion auf einem einzigen Chip implementieren, von großem Wert und sollten entwickelt werden.Darüber hinaus eignet sich LAMP für die in einem Chip integrierte Mehrzweckerkennung, was von großer Bedeutung ist, aber es gibt noch viel Raum für Entwicklung.
Die hohe Falsch-Positiv-Rate von LAMP kann teilweise mit RPA reduziert werden, da die relativ niedrige Reaktionstemperatur (~37 °C) zu relativ wenigen Verdunstungsproblemen führt [77].Im RPA-System initiieren zwei gegenüberliegende Primer die DNA-Synthese durch Bindung an eine Rekombinase, und die Amplifikation kann innerhalb von 10 Minuten abgeschlossen werden [78,79,80,81].Daher ist der gesamte RPA-Prozess viel schneller als PCR oder LAMP.In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass die Mikrofluidik-Technologie die Geschwindigkeit und Genauigkeit von RPA weiter verbessert [82,83,84].Liu et al.[85] entwickelten einen mikrofluidischen integrierten Lateral-Flow-Polymerase-Rekombinase-Amplifikationsassay für den schnellen und sensitiven Nachweis von SARS-CoV-2 durch die Integration von Reverse-Transkription-RPA (RT-RPA) und einem universellen Lateral-Flow-Teststreifen-Nachweissystem.in einem einzigen mikrofluidischen System.Abbildung 4b).Die Nachweisgrenze liegt bei 1 Kopie/µl oder 30 Kopien/Probe, und der Nachweis kann in etwa 30 Minuten abgeschlossen werden.Konget al.haben ein tragbares mikrofluidisches Gerät entwickelt.[86] verwendeten die Körpertemperatur und ein Mobiltelefon-basiertes Fluoreszenzdetektionssystem, um HIV-1-DNA schnell und direkt mit RPA nachzuweisen (Abbildung 4c).Der tragbare RPA-Assay erkennt 100 Kopien/ml der Zielsequenz innerhalb von 24 Minuten, was ein großes Potenzial für die schnelle Diagnose von HIV-1-infizierten Säuglingen in Umgebungen mit begrenzten Ressourcen zeigt.
Isotherme Amplifikation in Point-of-Care-Tests (POCT).Entwicklung und Produktion von Spin- und Reaktions-SlipChip.Nach dem Plasmaschweißen wurden die oberen und unteren Chips mit einem Satz Muttern zusammengefügt, um den endgültigen Chip zu bilden (nach [76]).b Schematische Darstellung des MI-IF-RPA-Systems zum COVID-19-Nachweis (adaptiert nach [85]).c Schema eines tragbaren RPA-Tests zum schnellen Nachweis von HIV-1-DNA (nach [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM Carboxyfluorescein, Human Immunodeficiency Virus HIV, RPA-Rekombinase-Polymerase-Amplifikation, LED-Leuchtdiode, MI-IF-RPA Microfluidics Integrated Lateral Flow Recombinase-Polymerase Verstärkung
Mikrofluidik-basiertes RPA entwickelt sich schnell, jedoch sind die Kosten für die Chipherstellung und den Reaktionsverbrauch zu hoch und müssen reduziert werden, um die Verfügbarkeit dieser Technologie zu erhöhen.Darüber hinaus kann die hohe Empfindlichkeit von RPA die Amplifikation unspezifischer Produkte beeinträchtigen, insbesondere bei Vorhandensein einer Kontamination.Diese Einschränkungen können die Anwendung von RPA in mikrofluidischen Systemen beeinträchtigen und eine weitere Optimierung verdienen.Gut konzipierte Primer und Sonden für verschiedene Ziele sind ebenfalls erforderlich, um die Durchführbarkeit von RPA-basierten mikrofluidischen Strategien in POCT zu verbessern.
Cas13 und Cas12a haben die Fähigkeit, Nukleinsäuren zufällig zu spalten und können daher als Nachweis- und Diagnosewerkzeuge entwickelt werden.Cas13 und Cas12a werden bei Bindung an Ziel-DNA bzw. -RNA aktiviert.Sobald das Protein aktiviert ist, beginnt es, andere Nukleinsäuren in der Nähe zu spalten, woraufhin Leit-RNAs, die auf erregerspezifische Nukleinsäuren abzielen, gelöschte fluoreszierende Sonden spalten und Fluoreszenz freisetzen können.Basierend auf dieser Theorie haben Kellner et al.[87] entwickelten eine Cas13-basierte Methode [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)] und Broughton et al.[88] entwickelten einen weiteren Ansatz basierend auf Cas12a [CRISPR Trans Reporter targeting DNA endonuclease (DTECR)].
In den letzten Jahren sind verschiedene Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren auf Basis von CRISPR erschienen [89, 90].Herkömmliche CRISPR-basierte Methoden sind oft zeitaufwändig und arbeitsintensiv aufgrund mehrerer Verfahren, einschließlich Nukleinsäureextraktion, Amplifikation und CRISPR-Nachweis.Der Kontakt von Flüssigkeiten mit Luft kann die Wahrscheinlichkeit falsch positiver Ergebnisse erhöhen.Vor diesem Hintergrund müssen CRISPR-basierte Systeme dringend optimiert werden.
Für CRISPR-Cas12a- und CRISPR-Cas13a-Detektionsanwendungen wurde eine pneumatisch gesteuerte mikrofluidische Plattform entwickelt, die 24 Analysen parallel durchführen kann [91].Das System ist mit einem Fluoreszenzdetektionsgerät ausgestattet, das die Nukleinsäureamplifikation umgeht und femtomolare DNA- und RNA-Proben automatisch erkennt.Chenet al.[92] integrierte Rekombinase-Amplifikation mit dem CRISPR-Cas12a-System in der zentrifugalen Mikrofluidik (Abb. 5a).Diese Arbeit überwindet die Schwierigkeit, diese beiden Prozesse zu integrieren, da Cas12a Messenger-DNA verdauen und den Amplifikationsprozess hemmen kann.Außerdem haben Chen et al.[92] lagerten die Reaktionsreagenzien zusätzlich in einer zentrifugalen mikrofluidischen Steuerung vor, um den gesamten Prozess automatisch abzuschließen.In einer anderen Arbeit beschreiben Silva et al.[93] entwickelten ein Diagnoseverfahren ohne CRISPR/Cas12a-Amplifikation und ein Smartphone zum Nachweis von SARS-CoV-2 (Abb. 5b).Dieser Assay, der als amplifikationsfreies System auf Mobiltelefonbasis bekannt ist, umfasst ein CRISPR/Cas-abhängiges Enzym, das auf der Smartphone-Visualisierung von Katalase-erzeugten Blasensignalen in mikrofluidischen Kanälen basiert.Empfindlicher Nachweis von weniger als 50 Kopien/µl Nukleinsäure ohne Voramplifikation, der gesamte Prozess von der Probeninjektion bis zum Ablesen des Signals dauert nur 71 Minuten.
Nukleinsäure-Nachweisverfahren basierend auf CRISPR.Zentrifugaler POCT für die integrierte molekulare Diagnostik basierend auf CRISPR (adaptiert nach [92]).b Entwicklung des CASCADE-Tests zur Smartphone-basierten Analyse von SARS-CoV-2 (adaptiert nach [93]).RAA-Rekombinase-Amplifikation, PAM-benachbartes Protospacer-Motiv, CRISPR geclusterte kurze palindromische Wiederholungen in regelmäßigen Abständen, CASCADE-System ohne Handy-Amplifikation mit CRISPR/CAS-abhängigen Enzymen, 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimid-Hydrochlorid-EDC
Als letzter Schritt beim Nukleinsäurenachweis spiegelt der Signalnachweis direkt die diagnostischen Ergebnisse wider und ist ein kritischer Faktor bei der Entwicklung eines effizienten, empfindlichen und genauen POCT.Signale können mit verschiedenen Methoden wie fluoreszierenden, elektrochemischen, kolorimetrischen und magnetischen Strategien gelesen werden.In diesem Abschnitt beschreiben wir die Gründe für jeden Ansatz und vergleichen die molekulare Diagnostik von Infektionskrankheiten in der Mikrofluidik.
Fluoreszenzbasierte Strategien werden häufig für die POCT-Diagnostik von Infektionskrankheiten eingesetzt, da sie bemerkenswerte Vorteile wie hervorragende Sensitivität, niedrige Kosten, einfache Bedienung und Point-of-Care-Analyse bieten [94, 95].Diese Strategien verwenden markierte Fluorophore wie fluoreszierende Farbstoffe und Nanomaterialien, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen (Fluoreszenzverstärkung oder -löschung).Dieser Befund legt nahe, dass fluoreszenzbasierte Strategien in direkte Fluoreszenzmarkierung, Signal-an- und Signal-aus-Fluoreszenzdetektion unterteilt werden können [96].Der direkte Fluoreszenzmarker-Nachweis verwendet spezielle Fluoreszenzmarker, um spezifische Liganden zu markieren, die eine spezifische Menge an Fluoreszenz erzeugen, wenn sie selektiv an ein Ziel gebunden werden.Bei der signalbasierten Fluoreszenzdetektion steht die Qualität des Fluoreszenzsignals in positiver Beziehung zur interessierenden Größe.Die Fluoreszenzintensität ist in Abwesenheit eines Ziels vernachlässigbar und ist nachweisbar, wenn eine ausreichende Menge an Ziel vorhanden ist.Umgekehrt ist die durch „Signal-Off“-Fluoreszenz detektierte Fluoreszenzintensität umgekehrt proportional zur Zielmenge, erreicht anfänglich einen Maximalwert und nimmt allmählich ab, wenn das Ziel vergrößert wird.Beispielsweise haben Tian et al.[97] entwickelten eine neuartige Erkennungsstrategie zum Nachweis von RNAs, die die reverse Transkription direkt umgehen (Abb. 6a).Bei Bindung an komplementäre Ziel-RNAs kann der CRISPR-Cas13-RNA-Komplex aktiviert werden, wodurch die transkollaterale Spaltung durch unspezifische Reporter-RNAs ausgelöst wird.Der fluoreszenzmarkierte Reporter [Fluorophor (F)] wird durch den intakten Quencher (Q) gequencht und fluoresziert, wenn er durch den aktivierten Komplex gespalten wird.
Der Vorteil der elektrochemischen Detektion ist eine hohe Detektionsgeschwindigkeit, einfache Herstellung, niedrige Kosten, einfacher Transport und automatische Steuerung.Es ist eine leistungsstarke Analysemethode für POCT-Anwendungen.Basierend auf Graphen-Feldeffekttransistoren haben Gao et al.[98] entwickelten einen Nanobiosensor für den Multiplex-Nachweis von Borreliose-Antigenen aus Borrelia burgdorferi-Bakterien mit einer Nachweisgrenze von 2 pg/mL (Abb. 6b).
Kolorimetrische Assays wurden in POCT-Anwendungen verwendet, wobei sie von den Vorteilen der Tragbarkeit, niedrigen Kosten, einfachen Herstellung und visuellen Ablesung profitierten.Der kolorimetrische Nachweis kann die Oxidation von Peroxidase oder Peroxidase-ähnlichen Nanomaterialien, die Aggregation von Nanomaterialien und die Zugabe von Indikatorfarbstoffen nutzen, um Informationen über das Vorhandensein von Zielnukleinsäuren in sichtbare Farbänderungen umzuwandeln [99, 100, 101].Insbesondere Goldnanopartikel werden häufig bei der Entwicklung kolorimetrischer Strategien verwendet, und aufgrund ihrer Fähigkeit, schnelle und signifikante Farbänderungen zu induzieren, besteht ein zunehmendes Interesse an der Entwicklung kolorimetrischer POCT-Plattformen für die In-situ-Diagnose von Infektionskrankheiten [102].Mit einem integrierten zentrifugalen mikrofluidischen Gerät [103] können lebensmittelbedingte Krankheitserreger in kontaminierten Milchproben automatisch auf der Ebene von 10 Bakterienzellen nachgewiesen werden, und die Ergebnisse können innerhalb von 65 Minuten visuell abgelesen werden (Abb. 6c).
Magnetische Erfassungstechniken können Analyten unter Verwendung magnetischer Materialien genau nachweisen, und es gab in den letzten Jahrzehnten ein erhebliches Interesse an POCT-Anwendungen.Magnetische Erfassungstechniken haben einige einzigartige Vorteile, wie z. B. kostengünstige magnetische Materialien anstelle teurer optischer Komponenten.Die Verwendung eines Magnetfelds verbessert jedoch die Nachweiseffizienz und reduziert die Probenvorbereitungszeit [104].Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse der magnetischen Sondierung eine hohe Spezifität, Empfindlichkeit und ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis aufgrund des unbedeutenden magnetischen Hintergrundsignals biologischer Proben [105].Sharma et al.integrierten einen auf magnetischen Tunnelkontakten basierenden Biosensor in eine tragbare Mikrochip-Plattform.[106] zum Multiplex-Nachweis von Pathogenen (Abb. 6d).Biosensoren detektieren empfindlich subnanomolare Nukleinsäuren, die aus Krankheitserregern isoliert wurden.
Typische Signalerkennungsmethode.Das Konzept des hyperlokalisierten Nachweises von Cas13a (adaptiert von [97]).b Graphen-Nanobiosensor FET in Kombination mit Lyme GroES scFv (nach [98]).c Kolorimetrische Indikationen für den Multiplex-Nachweis lebensmittelbedingter Krankheitserreger in einem zentrifugalen mikrofluidischen Chip: Proben Nr. 1 und Nr. 3 mit Zielerregern und Proben Nr. 2, Nr. 4 und Nr. 5 ohne Zielerreger (nach [103]) .d Biosensor basierend auf einem magnetischen Tunnelkontakt, einschließlich einer Plattform, eines eingebauten Sperrverstärkers, einer Steuereinheit und einer Stromversorgung zur Signalerzeugung/-erfassung (adaptiert von [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA Polymethylmethacrylat
Trotz der hervorragenden Eigenschaften der obigen Nachweisverfahren haben sie immer noch Nachteile.Diese Methoden werden verglichen (Tabelle 1), einschließlich einiger Anwendungen mit Details (Vor- und Nachteile).
Mit der Entwicklung von Mikrofluidik, mikroelektromechanischen Systemen, Nanotechnologie und Materialwissenschaften schreitet der Einsatz mikrofluidischer Chips zum Nachweis von Infektionskrankheiten stetig voran [55,96,107,108].Die präzise Manipulation von Miniaturgeräten und Flüssigkeiten trägt zur diagnostischen Genauigkeit und Kosteneffizienz bei.Für die weitere Entwicklung wurden daher Anstrengungen unternommen, die Chips zu optimieren und zu verbessern, was zu verschiedenen mikrofluidischen Chips mit unterschiedlichen Strukturen und Funktionen führte.Hier stellen wir kurz einige gängige Arten von mikrofluidischen Plattformen vor und vergleichen ihre Eigenschaften (Vor- und Nachteile).Darüber hinaus konzentrieren sich die meisten der unten aufgeführten Beispiele hauptsächlich auf die Bekämpfung von SARS-CoV-2.
LOCCs sind die am weitesten verbreiteten miniaturisierten komplexen Analysesysteme und ihre Abläufe sind stark miniaturisiert, integriert, automatisiert und parallelisiert von der Probeninjektion und -vorbereitung, der Flusskontrolle und der Flüssigkeitsdetektion [109, 110].Flüssigkeiten werden durch sorgfältig entworfene Geometrie und das Zusammenspiel vieler physikalischer Effekte wie Druckgradienten, Kapillarwirkung, Elektrodynamik, Magnetfelder und Schallwellen manipuliert [111].LOCC zeigt hervorragende Vorteile beim Hochdurchsatz-Screening und bei der Mehrfachdetektion mit hoher Analysegeschwindigkeit, kleiner Probengröße, geringem Stromverbrauch und hoher Verwaltungs- und Betriebseffizienz;LOCC-Vorrichtungen sind jedoch sehr empfindlich und müssen hergestellt, verpackt und angeschlossen werden.Multiplexing und Wiederverwendung stehen jedoch vor enormen Schwierigkeiten [96].Im Vergleich zu anderen Plattformen hat LOCC einzigartige Vorteile in Bezug auf maximale Anwendungsvielfalt und beste Technologiekompatibilität, aber auch seine Nachteile sind offensichtlich, nämlich hohe Komplexität und schlechte Wiederholbarkeit.Die Abhängigkeit von externen Pumpen, die oft sperrig und teuer sind, schränkt ihre Verwendung bei POCT weiter ein.
Während des Ausbruchs von COVID-19 erhielt LOCC viel Aufmerksamkeit.Gleichzeitig gibt es mehrere neue Chips, die mehrere Technologien kombinieren.Beispielsweise sind Smartphones heute weit verbreitet als tragbare Analysegeräte und haben ein großes Potenzial für die LOCC-Integration.Sunet al.[21] stellten einen mikrofluidischen Chip her, der es ermöglicht, spezifische Nukleinsäuresequenzen von fünf Krankheitserregern, einschließlich SARS-CoV-2, mit LAMP zu multiplexen und sie innerhalb von 1 Stunde nach dem Ende der Reaktion mit einem Smartphone zu analysieren.Als weiteres Beispiel haben Sundah et al.[112] schufen einen molekularen Schalter [katalytische Amplifikation durch molekularen Übergangszustandsschalter (CATCH)] für den direkten und sensitiven Nachweis von SARS-CoV-2-RNA-Targets mit Smartphones. CATCH ist mit tragbarem LOCC kompatibel und erreicht eine überlegene Leistung (ca. 8 RNA-Kopien/μl; < 1 h bei Raumtemperatur) [112]. CATCH ist mit tragbarem LOCC kompatibel und erreicht eine überlegene Leistung (ca. 8 RNA-Kopien/μl; < 1 h bei Raumtemperatur) [112]. Catch со & м & и п п п портативныы locc и беснчeicht CATCH ist mit tragbarem LOCC kompatibel und bietet einen hervorragenden Durchsatz (ca. 8 RNA-Kopien/µl; < 1 h bei Raumtemperatur) [112]. CATCH 便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH 便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH совместим с портативными LOCC и обладает превосходной производительностью (примерно 8 копий РНК/мкл; < 1 часа при комнатной температуре) [112]. CATCH ist mit tragbaren LOCCs kompatibel und hat eine hervorragende Leistung (ca. 8 RNA-Kopien/µl; < 1 Stunde bei Raumtemperatur) [112].Darüber hinaus nutzen LOCC-Geräte für die Molekulardiagnostik auch einige Antriebskräfte wie Vakuum, Dehnung und elektrische Felder.Kanget al.[113] demonstrierten eine ultraschnelle Nanoplasma-on-a-Chip-PCR in Echtzeit für die schnelle und quantitative Diagnose von COVID-19 im Feld unter Verwendung eines Vakuum-Plasmonen-Flüssigkeits-PCR-Chips.Liet al.[114] entwickelten daraufhin einen streckgesteuerten mikrofluidischen Chip, der die Diagnose von COVID-19 ermöglichte.Die Plattform verwendet das RT-LAMP-Amplifikationssystem, um festzustellen, ob eine Probe qualitativ positiv oder negativ ist.Anschließend haben Ramachandran et al.[115] erreichten geeignete elektrische Feldgradienten mit Isotachophorese (ITP), einer selektiven Ionenfokussierungstechnik, die in der Mikrofluidik implementiert ist.Mit ITP kann Ziel-RNA aus rohen Nasen-Rachen-Abstrichproben automatisch aufgereinigt werden.Dann Ramachandran et al.[115] Durch die Kombination dieser ITP-Reinigung mit ITP-verstärkten LAMP- und CRISPR-Assays wurde SARS-CoV-2 in humanen Nasen-Rachen-Abstrichen und klinischen Proben in etwa 35 Minuten nachgewiesen.Außerdem entstehen ständig neue Ideen.Jadhavet al.[116] schlugen ein diagnostisches Schema vor, das auf oberflächenverstärkter Raman-Spektroskopie in Kombination mit einer mikrofluidischen Vorrichtung basiert, die entweder vertikal ausgerichtete gold-/silberbeschichtete Kohlenstoffnanoröhren oder elektrogesponnene Mikro-/Nanoröhren zum Einmalgebrauch enthält.Membranfunktionalisierte eingebaute Filtermikrokanäle sind Einwegprodukte.Das Gerät adsorbiert Viren aus verschiedenen Körperflüssigkeiten/-ausscheidungen wie Speichel, Nasopharynx und Tränenflüssigkeit.Somit ist der Virustiter reichlich und das Virus kann durch die Raman-Signatur genau identifiziert werden.
LOAD ist eine zentrifugale mikrofluidische Plattform, bei der alle Prozesse durch ein Frequenzprotokoll gesteuert werden, das ein mikrostrukturiertes Substrat rotiert [110].Das LOAD-Gerät zeichnet sich dadurch aus, dass es die Zentrifugalkraft als wichtige Antriebskraft nutzt.Flüssigkeiten unterliegen auch Kapillar-, Euler- und Coriolis-Kräften.Unter Verwendung eines Zentrifugengeräts werden Analysen im kontinuierlichen Flüssigkeitsbetrieb von einer radial inneren nach einer äußeren Position durchgeführt, wodurch der Bedarf an zusätzlichen externen Schläuchen, Pumpen, Betätigungselementen und aktiven Ventilen entfällt.Kurz gesagt, ein einziges Steuerverfahren vereinfacht den Betrieb.Die auf die Flüssigkeit einwirkenden Kräfte im selben mikrofluidischen Kanal bei gleichem Abstand vom Lastzentrum sind gleich, was eine Wiederholung der Kanalstruktur ermöglicht.Somit ist die LOAD-Ausrüstung einfacher und wirtschaftlicher zu entwerfen und herzustellen als herkömmliche LOCC-Ausrüstung, während die Reaktionen weitgehend unabhängig und parallelisiert sind;Aufgrund der hohen mechanischen Festigkeit von Zentrifugalgeräten ist das verfügbare Spanmaterial jedoch begrenzt und kleine Volumina sind schwierig.zum Auto.Gleichzeitig sind die meisten LOAD-Geräte nur für den einmaligen Gebrauch konzipiert, was für die großflächige Detektion teuer ist [96, 117, 118, 119].
In den letzten Jahrzehnten hat LOAD, das als eines der vielversprechendsten mikrofluidischen Geräte gilt, beträchtliche Aufmerksamkeit von Forschern und Herstellern erhalten.Daher hat LOAD eine breite Akzeptanz erlangt und wurde für die molekulare Diagnostik von Infektionserregern eingesetzt [120, 121, 122, 123, 124], insbesondere während des COVID-19-Ausbruchs.Zum Beispiel Ende 2020 haben Ji et al.[60] demonstrierten einen direkten RT-qPCR-Assay zum schnellen und automatisierten parallelen Nachweis von SARS-CoV-2- und Influenza-A- und -B-Infektionen in Rachenabstrichproben.Dann Xiong et al.[74] stellten eine LAMP-integrierte diskoide mikrofluidische Plattform für den schnellen, genauen und gleichzeitigen Nachweis von sieben Coronaviren der menschlichen Atemwege, einschließlich SARS-CoV-2, innerhalb von 40 Minuten vor.Anfang 2021 haben de Oliveira et al.[73] demonstrierten einen zentrifugalen mikrofluidischen Chip mit Polystyroltoner, der manuell mit einem Fingerspitzenrotator betrieben wurde, für die molekulare RT-LAMP-Diagnose von COVID-19.Anschließend haben Dignan et al.[39] stellten ein automatisiertes tragbares Zentrifugenmikrogerät zur Aufreinigung von SARS-CoV-2-RNA direkt aus Wangenabstrichschnitten vor.Medved et al.[53] schlugen ein Inline-SARS-CoV-2-Aerosol-Probenahmesystem mit einem kleinvolumigen rotierenden mikrofluidischen Fluoreszenzchip mit einer Nachweisgrenze von 10 Kopien/μl und einem minimalen Zyklusschwellenwert von 15 Minuten vor.Suarez et al.[75] berichteten kürzlich über die Entwicklung einer integrierten modularen zentrifugalen mikrofluidischen Plattform für den direkten Nachweis von SARS-CoV-2-RNA in hitzeinaktivierten Nasen-Rachen-Abstrichproben unter Verwendung von LAMP.Diese Beispiele zeigen die großen Vorteile und Versprechen von LOAD in der molekularen Diagnostik von COVID-19.
1945 präsentierten Muller und Clegg [125] erstmals mikrofluidische Kanäle auf Papier unter Verwendung von Filterpapier und Paraffin.2007 schuf die Whitesides-Gruppe [126] die erste funktionale Papierplattform für Protein- und Glukosetests.Papier ist zu einem idealen Substrat für die Mikrofluidik geworden.Das Papier hat inhärente Eigenschaften wie Hydrophilie und poröse Struktur, ausgezeichnete Biokompatibilität, geringes Gewicht, Flexibilität, Faltbarkeit, geringe Kosten, Benutzerfreundlichkeit und Bequemlichkeit.Klassische µPADs bestehen aus hydrophilen/hydrophoben Strukturen, die auf Papiersubstraten aufgebaut sind.Je nach dreidimensionaler Struktur lassen sich μPADs in zweidimensionale (2D) und dreidimensionale (3D) μPADs unterteilen.2D-µPADs werden hergestellt, indem hydrophobe Grenzen gebildet werden, um mikrofluidische Kanäle zu bilden, während 3D-µPADs normalerweise aus Stapeln von Schichten von 2D-Mikrofluidikpapier hergestellt werden, manchmal durch Papierfaltung, Gleittechniken, offene Kanäle und 3D-Druck [96].Wässrige oder biologische Flüssigkeiten auf dem μPAD werden hauptsächlich durch Kapillarkraft ohne externe Stromquelle gesteuert, was die Vorlagerung von Reagenzien, die Probenhandhabung und den Multiplex-Nachweis erleichtert.Eine genaue Flusskontrolle und Multiplex-Erkennung werden jedoch durch unzureichende Erkennungsgeschwindigkeit, Empfindlichkeit und Wiederverwendbarkeit behindert [96, 127, 128, 129, 130].
Als ungewöhnliche mikrofluidische Plattform wurde μPAD für die molekulare Diagnose von Infektionskrankheiten wie HCV, HIV und SARS-CoV-2 umfassend beworben und entwickelt [131, 132].Für den selektiven und sensitiven Nachweis von HCV haben Tengam et al.[133] entwickelten einen neuartigen Biosensor auf Basis von fluoreszierendem Papier unter Verwendung einer hochspezifischen Nukleinsäuresonde auf Basis von Pyrrolidinylpeptid.Nukleinsäuren werden kovalent auf teilweise oxidiertem Zellulosepapier durch reduktive Alkylierung zwischen Aminogruppen und Aldehydgruppen immobilisiert, und der Nachweis basiert auf Fluoreszenz.Diese Signale können von einem speziell angefertigten Gerät mit einer tragbaren Fluoreszenzkamera in Kombination mit einer Handykamera gelesen werden.Anschließend haben Lu et al.[134] entwarfen eine papierbasierte flexible Elektrode auf Basis von Verbundwerkstoffen aus Nickel/Gold-Nanopartikeln/Kohlenstoff-Nanoröhren/Polyvinylalkohol-Organometallgerüsten für den HIV-Target-Nachweis durch DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Methylenblau als DNA-Redoxindikator.Kürzlich haben Chowdury et al.[135] stellten ein hypothetisches Plattformdesign für Point-of-Care-µPAD-Tests unter Verwendung von rohem Patientenspeichel in Kombination mit LAMP und tragbarer Bildgebungstechnologie für den Nachweis von COVID-19-Analyten vor.
Lateral-Flow-Tests leiten Flüssigkeiten durch Kapillarkräfte und steuern die Flüssigkeitsbewegung durch die Benetzbarkeit und Eigenschaften von porösen oder mikrostrukturierten Substraten.Die Lateral-Flow-Geräte bestehen aus Probe, Konjugat, Inkubator und Detektion sowie absorbierenden Pads.Die Nukleinsäuremoleküle im LFA erkennen spezifische Binder, die an der Bindungsstelle vorgespeichert sind, und binden als Komplexe.Während die Flüssigkeit durch die Inkubations- und Detektionsplatten strömt, werden die Komplexe von den Fängermolekülen auf den Test- und Kontrolllinien eingefangen, wodurch Ergebnisse angezeigt werden, die direkt mit bloßem Auge abgelesen werden können.In der Regel kann LFA in 2-15 Minuten abgeschlossen werden, was schneller ist als die herkömmliche Erkennung.Aufgrund des speziellen Mechanismus erfordert LFA nur wenige Handgriffe und erfordert keine zusätzliche Ausrüstung, was es sehr benutzerfreundlich macht.Es ist einfach herzustellen und zu miniaturisieren, und die Kosten von Substraten auf Papierbasis sind geringer.Es wird jedoch nur zur qualitativen Analyse verwendet, und der quantitative Nachweis ist sehr schwierig, und die Multiplexing-Fähigkeit und der Durchsatz sind sehr begrenzt, und es kann jeweils nur eine ausreichende Nukleinsäure nachgewiesen werden [96,110,127].
Obwohl sich die meisten Anwendungen von LFA auf Immunoassays konzentrieren, ist die Verwendung von LFA für die Molekulardiagnostik in mikrofluidischen Chips ebenfalls effektiv und beliebt [136].Im Fall von Hepatitis-B-Virus, HIV und SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] schlugen eine Up-Conversion-Nanopartikel-LFA-Plattform vor und demonstrierten die Vielseitigkeit dieser miniaturisierten und tragbaren Plattform durch den empfindlichen und quantitativen Nachweis mehrerer Ziele wie HBV-Nukleinsäure.Darüber hinaus haben Fu et al.[138] demonstrierten einen neuartigen LFA basierend auf oberflächenverstärkter Raman-Spektroskopie für die quantitative Analyse von HIV-1-DNA bei niedrigen Konzentrationen.Für den schnellen und sensitiven Nachweis von SARS-CoV-2 haben Liu et al.[85] entwickelten eine Mikrofluidik-integrierte RPA-Lateral-Flow-Analyse, indem sie RT-RPA und ein universelles Lateral-Flow-Erkennungssystem in einem einzigen Mikrofluidiksystem kombinierten.
Die Anwendung verschiedener mikrofluidischer Plattformen variiert je nach spezifischen Studien, wobei die Fähigkeiten und Vorteile der Plattformen voll ausgenutzt werden.Mit erschwinglichen Ventilen, Pumpen und Kanälen ist LOCC die umfassendste Plattform für Anwendungsvielfalt und Interoperabilität mit dem größten Entwicklungsspielraum.Daher hoffen und empfehlen wir, die neuesten Studien am LOCC als ersten Versuch durchzuführen und die Bedingungen zu optimieren.Außerdem sollen effizientere und genauere Methoden entdeckt und in dem System verwendet werden.LOAD zeichnet sich durch die präzise Steuerung von Flüssigkeiten aus bestehenden LOCC-Geräten aus und zeigt einzigartige Vorteile bei Einzelantrieben durch Zentrifugalkraft ohne die Notwendigkeit externer Antriebe, während parallele Reaktionen getrennt und synchronisiert werden können.Somit wird LOAD in Zukunft die wichtigste mikrofluidische Plattform mit weniger manuellen Operationen und ausgereifteren und automatisierten Technologien werden.Die µPAD-Plattform kombiniert die Vorteile von LOCC und papierbasierten Materialien für kostengünstige Einwegdiagnostik.Daher sollte sich die zukünftige Entwicklung auf komfortable und etablierte Technologien konzentrieren.Darüber hinaus eignet sich der LFA gut für die Erkennung mit bloßem Auge, was verspricht, den Probenverbrauch zu reduzieren und die Erkennung zu beschleunigen.Ein detaillierter Plattformvergleich ist in Tabelle 2 dargestellt.
Digitale Analysen teilen die Probe in viele Mikroreaktoren auf, von denen jeder eine diskrete Anzahl von Zielmolekülen enthält [139, 140].Digitale Assays bieten erhebliche Vorteile für die Durchführung einer absoluten Quantifizierung, indem Tausende von parallelen biochemischen Experimenten gleichzeitig und einzeln in Kompartimenten im Mikrometermaßstab und nicht in einer kontinuierlichen Phase durchgeführt werden.Im Vergleich zur traditionellen Mikrofluidik können Kompartimentreaktionen das Probenvolumen reduzieren, die Reaktionseffizienz erhöhen und leicht in andere Analysemethoden integriert werden, ohne dass Kanäle, Pumpen, Ventile und kompakte Designs erforderlich sind [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Die folgenden zwei Verfahren werden in digitalen Assays verwendet, um eine gleichmäßige und genaue Trennung von Lösungen, einschließlich Reagenzien und Proben, wie Zellen, Nukleinsäuren und anderen Partikeln oder Molekülen, zu erreichen: (1) Tropfenemulsionen, die die Instabilität der Flüssigkeitsgrenzfläche ausnutzen;(2) Die Array-Teilung wird durch die geometrischen Beschränkungen der Vorrichtung ausgeführt.Bei der ersten Methode können Tröpfchen, die Reagenzien und Proben in Mikrokanälen enthalten, durch passive Methoden wie Gleichstrom, Querströmung, Flussfokussierung, stufenweise Emulgierung, Mikrokanalemulgierung und Membranen durch viskose Scherkräfte und Emulgierung mit Kanalwechsel erzeugt werden.Lokalisierung [143, 145, 146, 148, 149] oder durch aktive Methoden [150, 151], die durch elektrische, magnetische, thermische und mechanische Kontrolle zusätzliche Energie einbringen.Beim letzteren Ansatz wird die beste Einheitlichkeit des Fluidvolumens in mikrofluidischen Kammern geteilt, indem räumliche Strukturen gleicher Größe gehalten werden, wie z. B. Mikropits und Oberflächenarrays [152,153,154].Tröpfchen sind insbesondere große Strömungsabschnitte, die auch auf Elektrodenarrays basierend auf digitaler Mikrofluidik (DMF) erzeugt und manipuliert werden können.Die Elektrobenetzung von Dielektrika ist eine der am besten untersuchten DMF-Theorien, da die Elektrobenetzung von Dielektrika eine präzise Manipulation einzelner Tropfen, die Kontrolle der Form der Flüssigkeit und asymmetrische elektrische Signale ermöglicht, die durch verschiedene Seiten gehen [141, 144].Zu den Hauptoperationen mit Tröpfchen in DMF gehören Sortieren, Aufteilen und Zusammenführen [151, 155, 156], die in verschiedenen Bereichen der Analytik, insbesondere in der molekularen Detektion, angewendet werden können [157, 158, 159].
Der digitale Nukleinsäurenachweis ist eine molekulardiagnostische Technologie der dritten Generation nach konventioneller PCR und quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR), parallel zu Hochdurchsatzsequenzierung und Flüssigbiopsie.In den letzten zwei Jahrzehnten haben sich digitale Nukleinsäuren im Bereich der molekularen Diagnostik von Infektionserregern rasant entwickelt [160, 161, 162].Die absolute Quantifizierung des digitalen Nukleinsäurenachweises beginnt mit dem Packen von Proben und Reagenzien in einzelne Kompartimente, um sicherzustellen, dass jede Zielsequenz die gleiche Wahrscheinlichkeit hat, in jedes einzelne Kompartiment einzudringen.Theoretisch können jedem Abschnitt mehrere Zielsequenzen zugeordnet werden, oder es gibt kein unabhängiges Mikroreaktionssystem.Durch die verschiedenen oben beschriebenen Erfassungsmechanismen können Kompartimente mit mikrobiellen Zielsequenzen, die Signale oberhalb einer bestimmten Schwelle erzeugen, mit bloßem Auge oder durch eine Maschine sichtbar gemacht und als positiv gekennzeichnet werden, während andere Kompartimente, die Signale unterhalb der Schwelle erzeugen, als positiv gekennzeichnet werden .negative, die das Signal für jeden Abschnitt zu einem booleschen Wert machen.Somit können durch Berechnen der Anzahl der erzeugten Kompartimente und der Rate positiver Ergebnisse nach der Reaktion die Originalkopien der Testproben unter Verwendung der Poisson-Verteilungsformel abgeglichen werden, ohne dass eine Standardkurve erforderlich ist, die für quantitative Routineanalysen wie z. B. erforderlich ist als qPCR.[163] Verglichen mit traditionellen molekulardiagnostischen Methoden weist der digitale Nukleinsäurenachweis einen höheren Automatisierungsgrad, eine höhere Analysegeschwindigkeit und -empfindlichkeit, weniger Reagenzien, weniger Kontamination und ein einfacheres Design und eine einfachere Herstellung auf.Aus diesen Gründen wurde die Verwendung digitaler Assays, insbesondere tropfenbasierter Methoden, für die Molekulardiagnostik, die Amplifikations- und Signalauslesetechniken kombiniert, während des kritischen Ausbruchs von SARS-CoV-2 gut untersucht.Zum Beispiel Yin et al.[164] kombinierten Tröpfchen-Digital- und schnelle PCR-Methoden zum Nachweis der ORF1ab-, N- und RNase-P-Gene in SARS-CoV-2 in einem mikrofluidischen Chip.Bemerkenswerterweise war das System in der Lage, innerhalb von 115 Sekunden ein positives Signal zu identifizieren, was schneller ist als herkömmliche PCR, was auf seine Wirksamkeit bei der Point-of-Care-Erkennung hinweist (Abbildung 7a).Donget al.[165], Sowet al.[157], Chenet al.[166] und Alteri et al.[167] wandten auch Tröpfchen-Digital-PCR (ddPCR) an, um SARS-CoV-2 in einem mikrofluidischen System mit beeindruckenden Ergebnissen nachzuweisen.Um die Erkennungsrate weiter zu verbessern, haben Shen et al.[168] erreichten eine ddPCR-basierte Chip-Bildgebung in nur 15 s ohne den Einsatz von Bild-Stitching-Techniken, wodurch der ddPCR-Technologieprozess vom Labor bis zur Anwendung beschleunigt wurde.Es werden nicht nur thermische Amplifikationsverfahren wie PCR angewendet, sondern es werden auch isotherme Amplifikationsverfahren verwendet, um die Reaktionsbedingungen und eine schnelle Reaktion zu vereinfachen.Luet al.[71] entwickelten SlipChip für die Tröpfchenanalyse, der in der Lage ist, Tröpfchen unterschiedlicher Größe bei hoher Dichte in einem Schritt zu erzeugen und SARS-CoV-2-Nukleinsäuren mit digitaler LAMP zu quantifizieren (Abbildung 7b).Als sich schnell entwickelnde Technologie kann CRISPR auch eine wichtige Rolle beim digitalen Nukleinsäurenachweis durch bequeme kolorimetrische Bildgebung spielen, ohne dass zusätzliche Nukleinsäurefärbungen erforderlich sind.Ackermannet al.entwickelten eine kombinatorische Matrixreaktion zur Multiplex-Auswertung von Nukleinsäuren.[158] detektierten 169 humanassoziierte Viren, einschließlich SARS-CoV-2, in Tröpfchen, die CRISPR-Cas13-basierte Nukleinsäure-Nachweisreagenzien in einem Mikrotiterplatten-Assay enthielten (Abbildung 7c).Darüber hinaus können die isothermische Amplifikation und die CRISPR-Technologie im selben System verwendet werden, um die Vorteile beider zu kombinieren.Parket al.[169] Ein digitaler CRISPR/Cas12a-Assay wurde in einem kommerziellen mikrofluidischen Chip zum Nachweis von extrahiertem und durch Hitze abgetötetem SARS-CoV-2 basierend auf einer einstufigen RT-RPA mit einem kürzeren und höheren Signal-zu-Hintergrund-Nachweis entwickelt Zeitverhältnis., breiterer dynamischer Bereich und bessere Empfindlichkeit (Abb. 7d).Einige Beschreibungen dieser Beispiele sind in Tabelle 3 angegeben.
Typische digitale Plattform für den Nukleinsäurenachweis.a Der Rapid-Digital-PCR-Workflow besteht aus vier Hauptschritten: Probenvorbereitung, Verteilung des Reaktionsgemisches, Amplifikationsprozess und Target-Quantifizierung (adaptiert nach [164]).b Schematische Darstellung der Analyse von SlipChip-Tropfen auf Tropfenbildung bei hoher Dichte (nach [71]).c CARMEN-Cas-Workflow-Diagramm13 (adaptiert nach [158]).d Überblick über fortschrittliche digitale Virenerkennung mit CRISPR/Cas in einem Topf (adaptiert von [169]).W/O Wasser-in-Öl, Polydimethylsiloxan PDMS, PCR-Polymerase-Kettenreaktion, DAQ-Datenerfassung, PID-Proportional-Integral-Derivat, CARMEN-Kombinatorische Matrixreaktion zur Multiplex-Nukleinsäure-Evaluierung, SARS-CoV-2, schweres akutes respiratorisches Syndrom, Coronavirus 2 , RT Amplifikation der Reverse-Transkriptase-Rekombinase-Polymerase-RPA, S/B-Signal im Hintergrund