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Ding Jingnuo, Zhao Weifeng, Abteilung für Infektionskrankheiten, Erstes angegliedertes Krankenhaus der Universität Suzhou, Stadt Suzhou, Provinz Jiangsu, 215000 Tel.Tumoren des Verdauungssystems mit einem 5-Jahres-Gesamtüberleben von 14,1 %.Viele Patienten mit HCC werden in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, daher ist ein frühes Screening unerlässlich, um die Sterblichkeit durch HCC zu reduzieren.Zusätzlich zu häufig verwendeten Erkennungsindikatoren wie Serum-Alpha-Fetoprotein (AFP), Linsenlektin-reaktivem Alpha-Fetoprotein (AFP-L3) und abnormalem Prothrombin (Vitamin-K-Mangel-induziertes Protein II, PIVKA-II), Flüssigkeitsbiopsietechniken Es hat sich als diagnostisch wertvoll beim Nachweis von HCC erwiesen.Im Vergleich zu invasiven Verfahren kann die Flüssigkeitsbiopsie zirkulierende maligne Metaboliten nachweisen.Flüssigkeitsbiopsietechniken detektieren zirkulierende Tumorzellen, zirkulierende Tumor-DNA, zirkulierende RNA und Exosomen und werden für das frühe Screening, die Diagnose und die prognostische Bewertung von HCC verwendet.Dieser Artikel gibt einen Überblick über die Molekularbiologie und die Anwendung verschiedener Flüssigkeitsbiopsietechniken, um vielversprechende Biomarker zu isolieren, die praktikable Optionen für die frühzeitige Beurteilung von HCC sein könnten, um das frühe Screening von Hochrisiko-HCC-Gruppen zu verbessern.Schlüsselwörter: Flüssigkeitsbiopsietechnik, hepatozelluläres Karzinom, Hochrisikogruppe .
Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist ein häufiger bösartiger Tumor des Verdauungstrakts, der sowohl bei Männern als auch bei Frauen den sechsten Platz unter den Neuerkrankungen an bösartigen Tumoren einnimmt.1 Leberkrebs ist weltweit nach Lungen- und Darmkrebs die dritthäufigste Krebstodesursache und macht 8,3 % aller krebsbedingten Todesfälle durch bösartige Neubildungen aus.1 Die Prognose des HCC ist eng mit dem Stadium zum Zeitpunkt der Diagnose verbunden.Die Hauptgründe für das schlechte Überleben beim HCC sind intrahepatische Metastasen, portalvenöse Tumorthromben und Fernmetastasen, die eine Resektion ausschließen, und viele dieser Merkmale sind bei Patienten bereits zum Zeitpunkt der Diagnose vorhanden.
Basierend auf Diagnose- und Behandlungsrichtlinien sind die Hauptrisikofaktoren für die Entwicklung eines HCC Leberzirrhose, chronische Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) oder Hepatitis-C-Virus (HCV), alkoholische Fettlebererkrankung und nichtalkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD). ).2 Darüber hinaus gehören zu den Risikofaktoren für HCC eine aflatoxinkontaminierte Nahrungsaufnahme, Schistosomiasis, andere Ursachen von Zirrhose, Leberkrebs in der Familienanamnese, Diabetes, Fettleibigkeit, Rauchen und arzneimittelinduzierte Leberschäden.35- und 45-jährige Risikogruppen sollten sich regelmäßig ärztlich untersuchen lassen.Frühes Screening ist eine wichtige frühzeitige Behandlungsstrategie, um das Gesamtüberleben von Patienten mit HCC zu verbessern.
Biomarker wie AFP, AFP-L3 und PIVKA-II werden für ein frühes Screening auf HCC3,4 empfohlen.Flüssigbiopsietechniken haben vielversprechende Ergebnisse bei der Früherkennung und Behandlungsbewertung gezeigt.5,6 Signifikante Fortschritte wurden bei der HCC-Flüssigbiopsie erzielt, die möglicherweise eine höhere Sensitivität und Spezifität aufweist als häufig verwendete Serummarker wie AFP (Tabelle 1).
AFP ist ein weit verbreiteter Biomarker bei HCC und derzeit der detaillierteste Biomarker, der häufig für das frühe Screening, die Diagnose und die Bewertung der Krankheit verwendet wird.Ein anhaltend erhöhter AFP-Spiegel gilt als Risikofaktor für das Fortschreiten des HCC.7,8 Die Erkennungsrate des kleinen hepatozellulären Karzinoms (sHCC) steigt mit der Entwicklung von Ultraschall und Computertomographie, und AFP hat sich in der klinischen Praxis als besonders unempfindlich gegenüber dem Nachweis von hHCC erwiesen.Gemäß einer retrospektiven multizentrischen Studie9 wurde AFP-positiv in 46 % (616/1338) der HCC-Fälle und 23,4 % (150/641) der sHCC-Fälle gefunden.Darüber hinaus sind die AFP-Spiegel bei Patienten mit chronischer Lebererkrankung und Zirrhose erhöht.10 Somit hat AFP einen begrenzten Screening-Effekt für sHCC.11 Gemäß den Asia-Pacific Clinical Practice Guidelines for Hepatocellular Carcinoma wird die Verwendung von AFP nicht empfohlen.12 Klinische Beweise deuten darauf hin, dass PIVKA-II AFP bei der Behandlung von HCC überlegen ist und dass die Kombination von PIVKA-II und AFP dies hat einen höheren diagnostischen Wert bei HCC.13 Im Vergleich zur Gewebebiopsie weist die Flüssigkeitsbiopsie primär tumorassoziierte Metaboliten in Körperflüssigkeiten (Blut, Speichel, Pleuraflüssigkeit, Liquor cerebrospinalis oder Urin) nach und ist weniger invasiv für das Gewebe.14 Darüber hinaus können Flüssigbiopsien bösartige Merkmale widerspiegeln, die im Primärtumorgewebe nicht vorhanden sind.15 Flüssigbiopsien werden noch nicht für alle Tumorarten in der klinischen Praxis getestet, aber ihr diagnostisches Potenzial bei Krebs zieht die Aufmerksamkeit von Onkologen auf sich.16 Flüssigkeitsbiopsie kann zirkulierende Tumorzellen (CTCs), zirkulierende Tumor-DNA (cDNA), zirkulierende freie RNA (ecRNA) und Exosomen nachweisen.In diesem Artikel werden wir die Eigenschaften, Rolle und Anwendung verschiedener Flüssigkeitsbiopsietechniken beim frühen Screening von Hochrisiko-HCC-Gruppen diskutieren.
Extrazelluläre DNA (cfDNA) in Blutproben gesunder Personen wurde erstmals 1948 von Mandel et al. beschrieben.17 cfDNA ist ein zellfreies DNA-Fragment mit einer Länge von etwa 160–180 bp, das hauptsächlich aus Lymphozyten und myeloischen Zellen stammt.ctDNA ist ein spezifisches mutiertes DNA-Fragment, das von Tumorzellen in das periphere Blut freigesetzt wird und die genomische Information von Tumorzellen nach bestimmten pathophysiologischen Prozessen, einschließlich Nekrose, Apoptose und Ausscheidung, darstellt.Der Anteil von ctDNA an der gesamten cfDNA variiert stark mit dem Tumortyp, und es wird berichtet, dass cDNA-Fragmente typischerweise weniger als 167 bp lang sind.18 Die Studie von Underhill zeigte, dass cfDNA-Fragmente im Allgemeinen kürzer sind als normale cfDNA.19 Im Vergleich zu gesunden Personen ist die Gesamtlänge von cfDNA-Fragmenten im Blut von Krebspatienten kürzer, sodass cfDNA als Indikator für ein frühes Tumorscreening verwendet werden kann.Die Anreicherung bestimmter Teilmengen von cfDNA-Fragmentlängen kann den Nachweis von cDNA verbessern, die mit nicht-metastasierenden soliden Tumoren assoziiert ist.Studien haben gezeigt, dass ctDNA in über 75 % der fortgeschrittenen Bauchspeicheldrüsen-, Dickdarm-, Blasen-, Magen-Darm-, Leber-, Eierstock-, Brust-, Melanom- und Kopf-Hals-Krebse gefunden wird.20,21 Die Menge an ctDNA im Blut hängt jedoch von der Lage des Tumors ab.22 In einer Studie von Bettegoud wurde festgestellt, dass Patienten mit Dickdarm-, Brust-, Leber-, Lungen- und Prostatakrebs höhere cDNA-Werte in ihrem Blut aufweisen als andere Krebsarten.Im Gegensatz dazu war bei Patienten mit Mundhöhlenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Magenkrebs und Gliom die cDNA-Konzentration im Blut niedriger.einundzwanzig
Da ctDNA die gleichen genetischen Mutationen wie primäre Tumorzellen enthält, kann cDNA verwendet werden, um heterogene tumorspezifische Mutationen und epigenetische Veränderungen, einschließlich Methylierung, Hydroxymethylierung, Variationen einzelner Nukleotide und Variationen der Kopienzahl, nachzuweisen.dreiundzwanzig
Die DNA-Methylierung ist eine der häufigsten epigenetischen Veränderungen, die zu einer Genrepression führt.Im Vergleich zu normalen Zellen gibt es Unterschiede im Gesamtmethylierungsgrad des Tumorzellgenoms, insbesondere in der Methylierung von Tumorsuppressorgenen, die in einem frühen Stadium nachgewiesen werden können, was darauf hindeutet, dass Änderungen in der DNA-Methylierung ein Indikator für einen frühen sein können Nachweis der Tumorentstehung.Mit HCC assoziierte Tumorsuppressorgene können durch Promotormethylierung inaktiviert werden, wodurch die Tumorentstehung stimuliert wird.24 DNA-Methylierung ist aufgrund ihrer Gewebespezifität, Nachweisbarkeit und Altersunabhängigkeit ein idealer Marker für die Früherkennung von Tumoren.Darüber hinaus ist die DNA-Methylierung im Vergleich zu somatischen Mutationen häufiger, da es in jeder Region des Zielgenoms mehr Zielregionen und mehrere veränderte CpG-Stellen gibt.25 Zusätzlich zu mehreren CpG-Stellen wurde eine große Anzahl unabhängiger hypermethylierter Loci in ctDNA in DBX2, THY1, MT1M, INK4A, VIM, FBLN1 und RGS10 identifiziert.26 Xu et al.Ein Vergleich von cfDNA-Proben von 1098 HCC-Patienten und 835 gesunden Kontrollpersonen ergab, dass mit HCC assoziierte Gene stark mit den entsprechenden Plasma-cDNA-Methylierungssignaturen korrelieren.25 Basierend auf einer Laboranalyse wurde ein Vorhersagemodell entwickelt, das 10 Methylierungsmarker mit einer Sensitivität und Spezifität von 85,7 % bzw. 94,3 % enthält, und diese Marker korrelierten stark mit der Tumormasse, dem Tumorstadium und dem Ansprechen auf die Behandlung.Diese Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung von cDNA-Methylierungsmarkern bei der Diagnose, Überwachung und Prognose von HCC sehr vielversprechend ist.In einem Methylierungsmodell, bestehend aus drei aberrant methylierten Genen (APC, COX2, RASSF1A) und einer miRNA (miR203), das von Lu et al.27 vorgestellt wurde, waren die Sensitivität und Spezifität von Modell 27 für die Diagnose von HBV-assoziiertem HCC vergleichbar.80%.Darüber hinaus konnte das Modell 75 % der nicht diagnostizierten HCC-Patienten mit einem AFP-Wert von 20 ng/ml erkennen.Das Gen für das Protein der Ras-assoziierten Domänenfamilie 1A (RASSF1A) ist die wichtigste repetitive DNA-Sequenz im menschlichen Genom.Araujoet al.kamen zu dem Schluss, dass die Hypermethylierung des RASSF1A-Promotors ein wertvoller Biomarker für das frühe Screening von HCC und ein potenzielles molekulares Ziel für eine epigenetische Therapie sein könnte.28 In einer Studie wurde bei 73,3 % der Patienten mit HCC eine Hypermethylierung des RASSF1A-Promotors im Serum festgestellt.29 Das lange eingestreute Nukleotidelement 1 (LINE-1) ist ein weiterer hochaktiver Retrotranspositionsmediator.Hypomethylierung von LINE-1 wurde in der DNA von 66,7 % der HCC-Serumproben gefunden und war mit frühem Wiederauftreten und schlechtem Überleben nach radikaler Resektion verbunden.29 Hypermethylierung ist ein allgemeiner genetischer Prozess, der eine einzigartige Rolle bei der Entwicklung von Leberzirrhose und HCC spielt.30 Im Gegensatz dazu ist die Hydroxymethylierung ein Demethylierungsprozess, der eine Genreaktivierung und -expression induziert, und der Nachweis des Produkts 5-Hydroxymethylcytosin (5-hmC) in diesem Prozess kann zur Identifizierung eines Tumors verwendet werden.Methylierung und Hydroxymethylierung von cDNA sind mit der Tumorentstehung assoziiert und können zum frühen Screening von HCC beitragen.In einer Studie mit 2554 Probanden wurden 31 genomweite 5-hmCs in cfDNA-Proben gefunden, und 32 Gene wurden durch den Vergleich von 5-hmC-Sequenzen bei HCC-Patienten und Hochrisikogruppen wie solchen mit chronischen Erkrankungen identifiziert.Diagnostische Modelle von Lebererkrankungen.und Zirrhose.Dieses Modell war AFP bei der Unterscheidung von HCC und Nicht-Tumorgewebe überlegen.
Mutationen in codierenden Regionen können zu transkriptionellen Anomalien führen, die zu Veränderungen in Proteinsequenzen und schließlich zu Krebs führen können.Einzelnukleotidvarianten sind aufgrund ihrer hohen Gewebezuverlässigkeit und hohen Tumor- und Gewebespezifität wichtige genomische Marker für das frühe Tumorscreening.Zahlreiche HCC-bezogene Studien mit Next-Generation-Sequencing (NGS) für die Exom- und Gesamtgenomsequenzierung von Krebs haben gemeinsame mutierte zelluläre Gene wie TP53 und CTNNB1 sowie mehrere, darunter ARID1A, MLL, IRF2, identifiziert.Die neuen Gene ATM, CDKN2A, FGF19, PIK3CA, RPS6KA3 und JAK1 zeigen moderate Mutationsraten. Mutantengenfunktionsanalysen deuten darauf hin, dass Veränderungen beim Chromatin-Remodeling, Wnt/β-Catenin und JAK/STAT-Signaltransduktion, dem P53-Zellzyklusweg, epigenetischen Modifikatoren, oxidativen Stresswegen, dem PI3K/AKT/MTOR-Weg und dem RAS/RAF/ Der MAPK-Kinase-Weg spielt eine entscheidende Rolle bei der HCC-Onkogenese.32,33 In einer Studie, in der tumorassoziierte Mutationen nachgewiesen wurden, fanden Huang et al. heraus, dass die Häufigkeit tumorassoziierter Mutationen in Abhängigkeit von ctDNA 19,5 % und die Spezifität 90 % betrug. .34 Darüber hinaus hatten Patienten mit Gefäßinvasion eher ctDNA-Mutationen (p = 0,041) und ein kürzeres rezidivfreies Überleben (p < 0,001). Mutantengenfunktionsanalysen deuten darauf hin, dass Veränderungen beim Chromatin-Remodeling, Wnt/β-Catenin und JAK/STAT-Signaltransduktion, dem P53-Zellzyklusweg, epigenetischen Modifikatoren, oxidativen Stresswegen, dem PI3K/AKT/MTOR-Weg und dem RAS/RAF/ Der MAPK-Kinase-Weg spielt eine entscheidende Rolle bei der HCC-Onkogenese.32,33 In einer Studie, in der tumorassoziierte Mutationen nachgewiesen wurden, fanden Huang et al. heraus, dass die Häufigkeit tumorassoziierter Mutationen in Abhängigkeit von ctDNA 19,5 % und die Spezifität 90 % betrug. .34 Darüber hinaus hatten Patienten mit Gefäßinvasion eher ctDNA-Mutationen (p = 0,041) und ein kürzeres rezidivfreies Überleben (p < 0,001).Mutantengenfunktionsanalysen deuten darauf hin, dass Änderungen beim Chromatin-Remodeling, Wnt/β-Catenin und JAK/STAT-Signalweg, P53-Zellzyklusweg, epigenetischen Modifikatoren, oxidativen Stresswegen, PI3K/AKT/MTOR-Weg und RAS/RAF/MAPK-Kinase-Weg spielen eine entscheidende Rolle bei der HCC-Tumorentstehung.32,33 In einer Studie, die Tumor-assoziierte Mutationen fand, fanden Huang et al.fanden heraus, dass die Häufigkeit von ctDNA-abhängigen Tumor-assoziierten Mutationen 19,5 % und die Spezifität 90 % betrug..34 к ое т т т у п п ициентов с с суууистой инвазией чащщ в & рчч и м м к к к к к к & ка к & ка к & ко к & ко к & к к & ко & к & коя к & ко & к & к к & ко & ко & к & ко & к & ко & к & ко & к & ко к & к & к к & ко & ко & ко & ко & ко & ко & ко & ко & ко & ко & ко & ко & ко & ко & ко & ко & к & ко & к & ко & к & ativ к & к & к & iges к & ко &; .34 Darüber hinaus hatten Patienten mit vaskulärer Invasion mehr cDNA-Mutationen (p = 0,041) und ein kürzeres krankheitsfreies Überleben (p < 0,001).Die funktionelle Analyse der mutierten Gene ergab Chromatin-Umbau, Wnt/β-Catenin und JAK/STAT-Signalisierung, den P53-Zellzyklusweg, epigenetische Modifikatoren, den oxidativen Stressweg, den PI3K/AKT/MTOR-Weg und den RAS/RAF/MAPK Kinase-Weg spielen eine entscheidende Rolle bei der Onkogenese von HCC. 32,33 在 一 项 到 肿瘤 相关 突变 的 研究 中 ， huang 等 发现 肿瘤 肿瘤 相关 突变 依赖于 依赖于 依赖于 依赖于 的 为 为 为 为 的 患者 更 特异性 为 为 为 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 发生 ctdna P = 0,041 und P < 0,001. 32.33 在 一 项 检测 到 相关 突变 的 研究 ， huang 等 发现 肿瘤 相关 突变 依赖于 ctdna 的 为 为 19.5% ， 特异性 为 90% .34 此外 经历 血管 侵犯 的 更 可能 发生 ctdna突变（P=0.041）和更0,001 P < 0,001.32,33 In einer Studie, die Tumor-assoziierte Mutationen fand, fanden Huang et al.fanden heraus, dass tumorassoziierte Mutationen zu 19,5 % von cDNA mit einer Spezifität von 90 % abhängig waren 34. Darüber hinaus entwickelten Patienten, die sich einer Gefäßinvasion unterzogen hatten, mit größerer Wahrscheinlichkeit cDNA.мутация (P = 0,041) und более короткая безрецидивная выживаемость (P <0,001). Mutation (P=0,041) und kürzeres krankheitsfreies Überleben (P<0,001).Ein weiteres häufiges HCC-Treibergen ist TP53, das eine Mutationsrate von über 30 % aufweist.Studien haben gezeigt, dass die Häufigkeit von TP53-Mutationen in ctDNA in Blut und Urin zwischen 5 % und 60 % liegt.35 Johans Studie zeigte, dass das ctDNA-Mutationsspektrum im späten HCC eine ähnliche Mutationsrate wie im frühen HCC aufweist, einschließlich des TERT-Promotors (51 %), TP53 (32 %), CTNNB1 (17 %), PTEN (8 %), Mutationen in AXIN1 ., ARID2, KMT2D und TSC2 (jeweils 6 %).36 Das Onkogen β-Catenin (CTNNB1) spielt eine wichtige Rolle im Wnt-Signalweg.Der Transkriptionskoaktivator CTNNB1 kann die Genexpression fördern, was zu Zellproliferation, Hemmung der Apoptose und Angiogenese führen kann.CTNNB1 kann auch mit TERT interagieren, um eine Hepatozytentransformation zu induzieren.33 Der TERT-Promotor ist in einigen soliden Tumoren häufig mutiert.Veränderungen in TERT, einer der frühesten genetischen Veränderungen bei der malignen Transformation von HCC, können zu einer Telomerase-Reaktivierung in zirrhotischen Hepatozyten führen und die Proliferation fördern und Alterung verhindern.Es wurde berichtet, dass Mutationen im 33-37 TERT-Promotor bei 59-90 % der Patienten mit proliferativen Leberknoten und frühem HCC auftreten und mit dem Überleben in Verbindung stehen.38
Copy Number Changes (CNA) sind ein wichtiger Subtyp somatischer Mutationen.Die Forschung hat gezeigt, dass die weit verbreitete und fokale Belastung durch CNA eine genomische Signatur ist, die in der Lage ist, die Tumorimmuninfiltration und den Ausschluss bei einigen Krebsarten vorherzusagen.39 Aktive Infiltrationssignale, hohe zytolytische Aktivität, schwere Entzündung und genetische Marker im Zusammenhang mit der Antigenpräsentation bei HCC.Die Analyse des Datenarrays von Einzelnukleotid-Polymorphismen bei 477 Probanden ergab eine geringe Belastung des ZNS.Im Gegensatz dazu zeigten chromosomal instabile Tumoren mit einer hohen ausgedehnten CNA-Last Anzeichen einer Immunabstoßung und waren mit Proliferation, DNA-Reparatur und TP53-Dysfunktion assoziiert.Xu et al.zeigten, dass die HCC-Gruppe höhere CNA-Scores aufwies als die Gruppe mit chronischen Lebererkrankungen.40 Unter Verwendung der Gesamtgenomsequenzierung einer einzelnen Zelle wurde festgestellt, dass CNAs früh in der Hepatokarzinogenese auftauchen und während der Tumorprogression relativ stabil bleiben.41 Chung et al.fanden heraus, dass die cfDNA-Spiegel bei HCC-Patienten signifikant erhöht waren und dass genomweite CNAs in cfDNA ein wichtiger unabhängiger prognostischer Marker bei mit Sorafenib behandelten HCC-Patienten waren.42 Bei Patienten mit einer höheren CNA-Belastung war die Wahrscheinlichkeit einer Krankheitsprogression und des Todes höher als bei Patienten mit einer geringeren CNA-Belastung.Ollerichet al.fanden heraus, dass der Copy Number Instability Index (CNI) zur Bewertung von CNA in cfDNA von Krebspatienten verwendet werden kann.Sie stellten fest, dass Patienten mit fortgeschrittenem Krebs signifikant höhere CNI-Werte aufwiesen als eine Kontrollgruppe, die das Ansprechen der Patienten auf eine systemische Chemotherapie und Immuntherapie bewertet.43 Diese Ergebnisse legen nahe, dass in Flüssigbiopsieproben gefundene CNAs als prognostische Indikatoren bei Patienten mit fortgeschrittenem Krebs dienen können.HCC vor dem Hintergrund der systemischen Therapie.
Derzeit können die Methoden zum Nachweis von ctDNA in zielgerichtete und nicht zielgerichtete Methoden unterteilt werden.Kurz gesagt, zielgerichtete Methoden wie digitale Polymerase-Kettenreaktion (dPCR), digitale BEAMing-PCR, Amplification Refractory Mutation System-PCR, Capp-Seq und Tam-Seq sind sehr empfindlich gegenüber vordefinierten Genen.Off-Target-Methoden wie Whole Genome Sequencing und NGS bieten einen umfassenden Überblick über die gesamte genomische Landschaft.44 Im Vergleich zu Target-Panels kann die Gesamtgenomsequenzierung nicht nur Punktmutationen und Insertionen erkennen, sondern auch Umlagerungen und Variationen der Kopienzahl.Prognose, und CTC und cfDNA sind gute Indikatoren, die für die dynamische Überwachung von HCC verwendet werden können.45 Darüber hinaus kann die cfDNA-Analyse beim Nachweis von HCC nützlicher sein.Yanet al.zeigten, dass cfDNA im Plasma von Patienten mit HCC signifikant höher war als bei Patienten mit Leberfibrose und gesunden Kontrollpersonen.Im Vergleich zu AFP wird erwartet, dass ctDNA ein besserer Screening-Marker für frühes HCC ist.46 In einer prospektiven Studie mit 47 Flüssigbiopsien, die cfDNA und Protein in einer Bevölkerungsgruppe testeten, wurde gezeigt, dass sie bei der Unterscheidung von Patienten mit HCC von Patienten ohne HCC wirksam sind.In einer Nachuntersuchung von 331 normalen und AFP-negativen Ultraschallpatienten betrug die Sensitivität und Spezifität von cfDNA für die Diagnose von HCC 100 % bzw. 94 %, sodass cDNA HCC bei asymptomatischen HBsAg-seropositiven Personen nachweisen konnte.In der Yeo48-Studie wurde bei Patienten mit HCC eine hohe Häufigkeit (92,5 %) von Hypermethylierung des RASSF1A-Promotors gefunden.Außerdem haben Xu et al.erstellten ein diagnostisches Modell zur Vorhersage von HCC unter Verwendung eines Panels spezifischer Methylierungsmarker mit einer Spezifität und Sensitivität von 90,5 % bzw. 83,3 %.Das Panel ermöglicht es, Patienten mit HCC von Patienten mit anderen Lebererkrankungen zu unterscheiden, was besser ist als AFP.Sie fanden auch heraus, dass normale Kontrollpersonen, die positiv getestet wurden, Risikofaktoren für HCC aufweisen können, wie z. B. eine HBV-Infektion oder eine Vorgeschichte von Alkoholkonsum.25 Wir gehen davon aus, dass Hochrisikofaktoren für HCC die Hypermethylierung von cfDNA fördern können, die dann zum Fortschreiten von HCC beiträgt, und daher kann cfDNA eine Schlüsselrolle beim Screening auf Hochrisikogruppen spielen.Cai et al.fassen das gesamte Spektrum der ctDNA-Mutationen zusammen und bieten eine robuste Strategie zur Beurteilung der Tumorlast bei Patienten.49 Diese Strategie kann die Tumorentstehung im Median 4,6 Monate vor einer Bildgebungsänderung erkennen und hat im Vergleich zu den Serum-Biomarkern AFP, AFP-L3 und PIVKA-II eine überlegene diagnostische Leistung gezeigt.Der diagnostische Wert von cDNA-Tests wurde gezeigt, wenn keine Bildauswertung verfügbar ist, sodass cDNA-Tests bei der Diagnose von frühem HCC in Hochrisikogruppen von Wert sind.Kürzlich verwendeten Wissenschaftler die NGS-Technologie, um Indikatoren multivariater genetischer Variation (einschließlich 5-Hydroxymethylcytosin, 5′-Motiv, Fragmentierung, Nukleosomenspur, HIFI) in 3204 klinischen Proben und cfDNA zu analysieren.50 neu validierte HIFI-Modelle mit drei unabhängigen Trainings-, Test- und Testsets zeigten eine stabile und zuverlässige Unterscheidung zwischen HCC- und Nicht-HCC-Populationen mit einer Empfindlichkeit von 95,79 % bzw. 95,42 % in HCC-spezifischen Test- bzw. Testsets.Die Geschlechter waren 95,00 % bzw. 97,83 %.Der diagnostische Wert der HIFI-Methode ist höher als der von AFP bei der Unterscheidung von HCC und Zirrhose.Darüber hinaus wird ctDNA auch in der chirurgischen Behandlung eingesetzt.Atsushiet al.bestimmten die präoperativen Serumspiegel von ctDNA bei Patienten mit HCC und stellten fest, dass die Rezidivrate und die extrahepatische Metastasierungsrate in der cDNA-positiven Gruppe signifikant höher waren als in der cDNA-negativen Gruppe und die cDNA-Spiegel signifikant korrelierten.mit Tumorprogression.51 Als hochempfindlicher Biomarker kann ctDNA die Fähigkeit von HCC vorhersagen, in Gefäße einzudringen.Wanget al.führten eine Gesamtgenomsequenzierung von 46 Patienten mit HCC durch, und multivariate Analysen zeigten, dass der Schwellenwert der Allelhäufigkeit der cDNA-Variante für die Invasion in Mikrogefäße 0,83 %, die Sensitivität 89,7 % und die Spezifität 80,0 % beträgt.ein unabhängiger Risikofaktor für eine mikrovaskuläre Invasion bei resezierbarem HCC, was darauf hindeutet, dass cDNA bei der optimalen Behandlung helfen kann.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ctDNA vollständig am Auftreten und der Entwicklung von HCC beteiligt ist und für ein frühes Screening, eine chirurgische Bewertung und eine Krankheitsüberwachung verwendet werden kann.
CTCs sind bösartige Zellen, die von Primärtumoren oder Metastasen stammen, die in den Blutkreislauf metastasieren.Tumorzellen sezernieren Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), die die Basalmembran abbauen, wodurch Tumorzellen direkt in die Blut- und Lymphgefäße gelangen können.Die meisten CTCs werden jedoch schnell durch Anoikis, Immunangriffe oder Scherstress eliminiert.53 Der epithelial-mesenchymale Übergang (EMT) ermöglicht es CTCs, leicht aus dem primären Tumorgewebe isoliert zu werden, in die Kapillaren einzudringen und eine signifikant verbesserte Überlebensrate, Metastasierung, Invasivität und Arzneimittelresistenz zu erlangen.Studien haben gezeigt, dass zwischen den verschiedenen Tumorzellen in primären metastatischen Tumoren eine tiefgreifende Heterogenität besteht.Somit kann die CTC-Analyse zu einem umfassenden Verständnis der Heterogenität von Tumorzellen führen.54
Zu den spezifischen Markern für HCC-assoziierte CTCs gehören Glypican-3 (GPC3), Asialoglycoprotein-Rezeptor (ASGPR), Epithelialzell-Adhäsionsmolekül (EpCAM) und Stammzell-assoziierte Marker wie CD44, CD90, 55 und interzelluläres Adhäsionsmolekül 1 (ICAM1).) .56 Der GPC3-Marker ist ein in der Zellmembran verankertes Protein, das klinisch für die pathologische Analyse und Charakterisierung von HCC verwendet wird.57 Die Expression von GPC3 ist häufiger in HCC-Tumorzellen mit mittlerer und geringer Differenzierung und fördert die extrahepatische Migration;Darüber hinaus weist das Vorhandensein von GPC3+ CTCs auf metastasierendes HCC hin.58 ASGPR ist ein Transmembranprotein, das nur auf der Oberfläche von Hepatozyten exprimiert wird und in gut differenziertem HCC stark exprimiert wird.EpCAM ist eines der am häufigsten verwendeten membranassoziierten Proteine ​​zum Einfangen von CTCs.EpCAM wurde als Oberflächenmarker von HCC-Zellen mit Stammzelleigenschaften identifiziert,59 der mit verschiedenen klinisch-pathologischen Merkmalen von HCC korreliert, wie Gefäßinvasion, bewertete AFP-Spiegel und Leberkrebs im fortgeschrittenen Stadium im Krankenhaus von Barcelona (BCLC).Der 60 CTC EMT-Phänotyp ist stark metastasierend.54 EMT-Prozesse im CTC fördern die HCC-Metastasierung.Die Expression von EMT-Markern wie Vimentin, Twist, E-Box-Zinkfingerbindung (ZEB) 1, ZEB2, Schnecke, Nacktschnecke und E-Cadherin wurde in aus der Leber stammenden CTCs von HCC-Patienten untersucht.58 Das von Cheng [61] entwickelte CanPatrol™-System klassifizierte CTCs in drei phänotypische Untergruppen basierend auf überwiegend exprimierten Markern: epithelialer Phänotyp (EpCAM, CK8/18/19), mesenchymaler Phänotyp (Vimentin, Coiled) und gemischte Phänotypen.Bei 176 Patienten war die Gesamt-CTC der AFP bei der Unterscheidung zwischen HCC und gutartiger Lebererkrankung überlegen.Die AUC-Werte für Gesamt-CTC, AFP und kombinierte Gesamt-CTC und AFP waren 0,774 (95 % KI, 0,704–0,834), 0,669 (95 % KI, 0,587–0,750) und 0,821 (95 % KI, 0,756–0,886). ).), beziehungsweise.Die CTC-Klassifizierung basierend auf EMT kann die HCC-Diagnose, ein frühes Wiederauftreten, Metastasen und eine kürzere Gesamtzeit vorhersagen.
Gegenwärtig umfassen Verfahren zum Nachweis von CSCs physikalische Verfahren und biologische Verfahren.Physikalische Methoden, die oft als Anreicherung auf Basis biophysikalischer Eigenschaften bezeichnet werden, hängen hauptsächlich von den physikalischen Eigenschaften des CSC ab, wie Größe, Dichte, Ladung, Mobilität und Verformbarkeit.Je nach physikalischen Eigenschaften gibt es verschiedene Methoden wie filtrationsbasierte Systeme, Dielektrophorese etc. Letztere, auch Immunaffinitäts-basierte Anreicherung genannt, basiert hauptsächlich auf Antigen-Antikörper-Bindung, da bei der Methode Antikörper gegen tumorspezifische Biomarker verwendet werden wie EpCAM, ASGPR, humaner epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor 2 (HER2), prostataspezifisches Antigen (PSA), humanes Panzytokeratin (P-CK) und Carbamoylphosphatsynthase 1 (CPS1).62 Eine andere Art, die sogenannte No-Enrichment-Methode, verwendet Durchflusszytometrie, um CTCs von Leukozyten basierend auf einem höheren Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnis und einer höheren Größe zu unterscheiden.Derzeit ist der einzige von der FDA zugelassene Test zum Nachweis von CTCs das Cell-Search™-System, das den EpCAM-Zelloberflächenmarker verwendet. Ein kombinierter markerbasierter CTC-Nachweis könnte jedoch die Positivitätsrate erhöhen.54 Eine Mischung aus Antikörpern gegen ASGPR und CPS1 erreichte eine CTC-Nachweisrate von 91 % bei HCC-Patienten.63 Zhang et al. verwendeten einen CTC-Chip mit Antikörpern gegen ASGPR, P -CK und CPS1, und unterschied HCC-Patienten von Patienten mit gutartiger Lebererkrankung oder Nicht-HCC-Krebs mit einer Rate von 100 %.64 Eine Studie von Wang entdeckte EpCAM+ CTCs bei 60 % von 42 HCC-Patienten und fand signifikante Korrelationen zwischen beiden Positivitäten Rate und die Anzahl der CTCs im TNM-Stadium.65 Guo et al. fanden heraus, dass ein CTC-abgeleiteter PCR-Score bei 125/171 (73 %) Patienten, deren AFP-Spiegel < 20 ng/ml betrug, mit einer Sensitivität von 72,5 % und a Spezifität von 95,0 %, verglichen mit 57,0 % und 90,0 % für AFP bei einem Cutoff von 20 ng/ml.66 Die Kombination von AFP und CTCs kann den HCC-Nachweis verbessern.45 Es wird angenommen, dass CTCs beim frühen Screening von Gruppen einen Vorteil gegenüber AFP haben mit hohem HCC-Risiko. Ein kombinierter markerbasierter CTC-Nachweis könnte jedoch die Positivitätsrate erhöhen.54 Eine Mischung aus Antikörpern gegen ASGPR und CPS1 erreichte eine CTC-Nachweisrate von 91 % bei HCC-Patienten.63 Zhang et al. verwendeten einen CTC-Chip mit Antikörpern gegen ASGPR, P -CK und CPS1, und unterschied HCC-Patienten von Patienten mit gutartiger Lebererkrankung oder Nicht-HCC-Krebs mit einer Rate von 100 %.64 Eine Studie von Wang entdeckte EpCAM+ CTCs bei 60 % von 42 HCC-Patienten und fand signifikante Korrelationen zwischen beiden Positivitäten Rate und die Anzahl der CTCs im TNM-Stadium.65 Guo et al. fanden heraus, dass ein CTC-abgeleiteter PCR-Score bei 125/171 (73 %) Patienten, deren AFP-Spiegel < 20 ng/ml betrug, mit einer Sensitivität von 72,5 % und a Spezifität von 95,0 %, verglichen mit 57,0 % und 90,0 % für AFP bei einem Cutoff von 20 ng/ml.66 Die Kombination von AFP und CTCs kann den HCC-Nachweis verbessern.45 Es wird angenommen, dass CTCs beim frühen Screening von Gruppen einen Vorteil gegenüber AFP haben mit hohem HCC-Risiko.Der Marker-basierte kombinierte Nachweis von CTCs kann jedoch den Prozentsatz positiver Ergebnisse erhöhen.54 Eine Mischung aus Anti-ASGPR- und CPS1-Antikörpern erreichte eine CTC-Nachweisrate von 91 % bei Patienten mit HCC.63 Zhang et al.verwendeten einen CTC-Chip mit Antikörpern gegen ASGPR, P-CK und CPS1 und unterschieden auch Patienten mit HCC von solchen mit gutartiger Lebererkrankung oder Nicht-HCC mit einer Rate von 100 %.частота и количество ЦОК со стадией TNM.65 Guo и соавторы обнаружили, что показатель ПЦР, полученный из ЦОК, был повышен у 125/171 (73%) пациентов, у которых уровень АФП был <20 нг/мл с чувствительностью 72,5% и специфичность 95,0% по сравнению с 57,0% и 90,0% для АФП при пороговом уровне 20 нг/мл.66 Комбинация АФП и ЦОК может улучшить обнаружение ГЦК.45 Считается, что ЦОК имеют преимущество перед АФП при раннем скрининге групп. Häufigkeit und Anzahl von CTCs im TNM-Stadium.65 Guo et al. fanden heraus, dass die von CTCs abgeleitete PCR bei 125/171 (73 %) Patienten mit AFP-Werten < 20 ng/ml erhöht war, mit einer Sensitivität von 72,5 % und einer Spezifität von 95,0 % im Vergleich zu 57,0 % und 90,0 % für AFP bei einem Cut-off-Wert von 20 ng/ml.66 Die Kombination von AFP und CTCs kann den Nachweis von HCC verbessern.45 CTCs gelten als Vorteil gegenüber AFP beim frühen Screening Gruppen.mit hohem HCC-Risiko.Der Marker-basierte kombinierte Nachweis von CTCs kann jedoch den Prozentsatz positiver Ergebnisse erhöhen.54 Eine Mischung aus Anti-ASGPR- und CPS1-Antikörpern erreichte bei Patienten mit HCC eine CTC-Erkennungsrate von 91 %.63 Zhanget al.verwendeten CTC-Chips mit Antikörpern gegen ASGPR, P-CK und CPS1 und unterschieden Patienten mit HCC von benignen Lebererkrankungen und Nicht-HCC mit 100 %.64 Wangs Studie identifizierte 60 % der EpCAM+ CTCs bei 42 HCC-Patienten und stellte eine signifikante Korrelation zwischen der Inzidenz und der Anzahl von CTCs im TNM-Stadium fest. 65 Guo 等人发现，在AFP 水平<20 ng/mL 的125/171 (73%) 名患者中，CTC 衍生的PCR 评分升高，敏感性为72.5%，特异性为95.0%，而AFP 在截止20 ng/mL, 57,0 %, 90,0 %. 65 Guo 等 人 发现 在 在 在 水平 <20 ng/ml 的 125/171 (73%) 名 患者 ， ， ctc 衍生 pcr 评分 ， 敏感性 为 为 72.5%， 为 95.0%， AFP 在 截止 截止 截止 截止 截止 截止"65 Guoet al.обнаружили, что у 125/171 (73%) пациентов с уровнем АФП <20 нг/мл показатели ПЦР, полученные с помощью ЦОК, были повышены с чувствительностью 72,5% и специфичностью 95,0%, в то время как АФП на уровне отсечки Специфичность составляла 20 ng/ml. fanden heraus, dass bei 125/171 (73 %) Patienten mit AFP-Spiegeln < 20 ng/ml die CTC-abgeleiteten PCR-Werte mit einer Sensitivität von 72,5 % und einer Spezifität von 95,0 % erhöht waren, während AFP eine Cut-Off-Spezifität aufwies betrug 20 ng/ml.ml war 57,0 % und 90,0 %.66 Die Kombination von ORP und CTC verbessert den Nachweis von HCC.Es wird angenommen, dass 45 CTCs AFP beim frühen Screening von Hochrisiko-HCC-Populationen überlegen sind.Daher sollte bei CTC-positiven und Hochrisiko-HCC-Gruppen der CTC-Test routinemäßig mit Ultraschall und AFP-Nachweis kombiniert werden.CTCs gelten jedoch als wichtige Prädiktoren für Tumormetastasen und Rezidive, und der Nachweis von CTCs wird nicht unabhängig als diagnostisches Instrument empfohlen.62 Daher kann CTC als besserer prädiktiver Biomarker dienen als andere derzeit verwendete Marker. Zhou et al. fanden heraus, dass Patienten mit einer erhöhten Anzahl von EpCAM+ CTCs und regulatorischen T-Zellen ein höheres Risiko für die Entwicklung eines HCC-Rezidivs aufwiesen als Patienten mit einer niedrigen Anzahl von CTCs, mit einer Rezidivrate von 66,7 % gegenüber 10,3 % (p < 0,001).67 Über eine ähnliche Studie wurde von Zhong et al. berichtet.68 Darüber hinaus fand Qi heraus, dass 101 von 112 Patienten (90,81 %) mit HCC, einschließlich derjenigen im Frühstadium der Erkrankung, positiv auf CTCs waren und dass nach 3 sehr kleine HCC-Knötchen entdeckt wurden bis 5 Monate Follow-up. Zhou et al. fanden heraus, dass Patienten mit einer erhöhten Anzahl von EpCAM+ CTCs und regulatorischen T-Zellen ein höheres Risiko für die Entwicklung eines HCC-Rezidivs aufwiesen als Patienten mit einer niedrigen Anzahl von CTCs, mit einer Rezidivrate von 66,7 % gegenüber 10,3 % (p < 0,001).67 A über eine ähnliche Studie wurde von Zhong et al. berichtet.68 Darüber hinaus stellte Qi fest, dass 101 von 112 Patienten (90,81 %) mit HCC, einschließlich derjenigen im Frühstadium der Erkrankung, positiv auf CTCs waren und dass sehr kleine HCC-Knötchen nach 3 to entdeckt wurden 5 Monate Nachsorge. Чжоу и др.обнаружили, что у пациентов с повышенным количеством ЦОК EpCAM+ и регуляторных Т-клеток риск развития рецидива ГЦК был выше, чем у пациентов с низким количеством ЦОК, с коэффициентом рецидивов 66,7% против 10,3% (P <0,001)67. Zhou et al. fanden heraus, dass Patienten mit erhöhten EpCAM+ CTCs und regulatorischen T-Zellen ein höheres Risiko für ein HCC-Rezidiv hatten als Patienten mit niedrigen CTCs, mit einer Rezidivrate von 66,7 % vs. 10,3 % (p < 0,001)67.Eine ähnliche Studie wurde von Zhong et al.68. Darüber hinaus fand Qi heraus, dass 101 von 112 Patienten (90,81 %) mit HCC, einschließlich derjenigen mit früher Erkrankung, CTCs hatten und dass nach 3 bis 5 Monaten Nachbeobachtung sehr kleine HCC-Knötchen entdeckt wurden. Zhou 等人发现，与CTC 数量较少的患者相比，EpCAM+ CTC 和调节性T 细胞数量升高的患者发生HCC 复发的风险更高，复发率分别为66.7% 和10.3% (P < 0.001)。 Zhou 等 人 发现 与 与 ctc 数量 少 的 患者 相比 ， epcam+ ctc 和 t 细胞 数量 的 患者 发生 hcc 复发 风险 更 ， 复发率 分别 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 10.3% ( p<0,001)。。。。。。。。。。。。。。。 Чжоу и др.обнаружили, что пациенты с повышенным количеством ЦОК EpCAM+ и регуляторных Т-клеток имели более высокий риск рецидива ГЦК по сравнению с пациентами с меньшим количеством ЦОК, с частотой рецидивов 66,7% и 10,3% соответственно (P <0,001). Zhouet al.fanden heraus, dass Patienten mit erhöhten EpCAM+ CTCs und regulatorischen T-Zellen ein höheres Risiko für ein HCC-Rezidiv hatten als Patienten mit weniger CTCs, mit Rezidivraten von 66,7 % bzw. 10,3 % (p < 0,001).Eine ähnliche Studie wurde von Zhong et al.68 Darüber hinaus fand Qi heraus, dass 101 von 112 HCC-Patienten (90,81 %), einschließlich Patienten mit früher Erkrankung, positive CTC-Ergebnisse hatten und nach 3 Besuchen sehr kleine HCC-Knötchen fanden.Beobachtung bis zu 5 Monate.Sie fanden auch CTCs bei 12 Patienten mit chronischer HBV-Infektion und fanden innerhalb von 5 Monaten bei 2 CTC-positiven Patienten kleine HCC-Tumoren.69 Daher können CTCs zur Vorhersage von HCC verwendet werden, 70 aber sie können routinemäßiger als prädiktive Biomarker verwendet werden.
Wie cfDNA wird cfRNA durch verschiedene Systeme in den Blutkreislauf freigesetzt.Diese Moleküle im peripheren Blut repräsentieren das Ursprungsgewebe des Krebses.Im Vergleich zu Markern, die durch nicht-invasive Methoden nachgewiesen werden, sind cfRNAs dynamischer reguliert, gewebespezifisch und in der extrazellulären Umgebung reichlich vorhanden.Die Bedeutung und der diagnostische Wert von 71 miRNAs (miRNAs) bei HCC wurde in vielen Studien berichtet.miRNAs sind endogene nicht-kodierende RNAs (ncRNAs), die verschiedene molekularbiologische Aktivitäten regulieren, indem sie die Translation von Zielboten-RNAs (mRNAs) hemmen.miRNAs befinden sich in apoptotischen Körpern, die in Exosomen eingekapselt sind, aber sie können auch stabil an Serumproteine ​​und Lipide im peripheren Blut binden und zur Bewertung von HCC verwendet werden.microRNAs sind an der Leberregeneration, dem Fettstoffwechsel, der Apoptose, Entzündungen und der Entstehung von HCC beteiligt.72 Onkogene miRNAs wie miR-21, miR-155 und miR-221 sind bei HCC gut bekannt.Insbesondere miR-21 spielt eine Schlüsselrolle bei der Kollagensynthese in der extrazellulären Matrix und der Fibrose und fördert die Leberkrebsentstehung durch Aktivierung hämatopoetischer Stammzellen.72,73 Tumorsuppressor-miRNAs bei HCC umfassen miRNA-122, miRNA-29, die Let-7-Familie und die miRNA-15-Familie.Die Let-7-Familie besteht aus vielen Tumorsuppressor-miRNAs, die auf die RAS-Familie abzielen.Die miR-15-Familie umfasst miR-15a, miR-15b, miR-16, miR-195 und miR-497, die komplementäre Sequenzen für bestimmte mRNAs aufweisen.Darüber hinaus sind auch lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs) und zirkuläre RNAs (cirRNAs) für ein frühes Screening auf HCC wichtig.lncRNAs stellen die breiteste Klasse von ncRNAs dar, einschließlich mRNA-ähnlicher ncRNAs, und sind an der Pathogenese vieler menschlicher Krankheiten beteiligt.LncRNAs spielen eine regulatorische Rolle in der Mikroumgebung der Leber und bei chronischen Lebererkrankungen.74 CircRNAs sind ebenfalls eine Klasse von ncRNAs mit mehreren Funktionen bei der Regulation der Genexpression.Vor kurzem wurden circRNAs als diagnostische Werkzeuge für HCC in Betracht gezogen.
Zirkulierende freie RNA hat eine bemerkenswerte Stabilität, einschließlich Temperatur-, pH- und RNase-Beständigkeit, was die Isolierung von fnRNA aus peripherem Blut mit Standard-RNA-Reinigungsmethoden weniger mühsam macht.Zu den am häufigsten verwendeten Methoden gehören NGS, Microarray und RT-qPCR.NGS ermöglicht die Messung von microRNAs im gesamten Genom.Diese Methode ist jedoch teuer und die Analyse nicht standardisiert.Im Gegensatz dazu ist RT-qPCR kostengünstig, amplifiziert Nukleinsäuren schnell und bietet viele Vorteile wie höhere Empfindlichkeit, höhere Genauigkeit, einen größeren dynamischen Bereich und weniger Proben.Microarrays sind eine weitere Methode, die für den miRNA-Nachweis verwendet wird, basierend auf einer empfindlichen und spezifischen Hybridisierung von Ziel-miRNAs mit komplementären DNA-Sonden, 75 aber die Analyse von Microarray-Daten ist zeitaufwändig.
Es wurde berichtet, dass zirkulierendes miR-122 und Let-7 potenziell nützlich bei der Diagnose von HCC im Frühstadium in Hochrisikogruppen, Markern bei Patienten mit HBV-assoziierten prämalignen Knötchen und HCC im Frühstadium sind.76 Cai et al.fanden heraus, dass Mitglieder der Let-7-Familie (miR-92, miR-122, miR-125b, miR-143, miR-192, miR-16, miR-126 und miR-199a/b) einem chronischen Risiko ausgesetzt sind HCC bei Patienten mit Hepatitis.Die Let-7-Familie kann als wirksamer Surrogat-Biomarker zur Vorhersage der Entwicklung von HCC in Hochrisikogruppen im Zusammenhang mit chronischer Hepatitis C dienen. 77 miR-122 hat eine hohe diagnostische Genauigkeit beim Nachweis eines frühen HCC bei Patienten mit Leberzirrhose.78 Das im Serum zirkulierende MiR-107 wurde auch in den frühen Stadien des HCC evaluiert, 79 und hat ein gutes Potenzial in Hochrisikopopulationen gezeigt.Zhou et al. berichteten, dass ein Panel von miRNAs (miR-122, miR-192, miR-21, miR-223, miR-26a, miR-27a und miR-801) HCC von chronischer Hepatitis B (CHB) und Zirrhose unterscheiden kann die Sensitivität betrug 79,1 % bzw. 75 % und die Spezifität 76,4 % bzw. 91,1 %.80 Bei HBV-bedingtem HCC stellten wir fest, dass die miR150-Spiegel im Vergleich zu denen bei chronischen HBV-Patienten ohne HCC signifikant reduziert waren (Sensitivität 79,1 %, Spezifität 76,5 %).-224 war bei HCC im Vergleich zu gesunden Kontrollen erhöht, und Untergruppenanalysen zeigten höhere Werte bei Patienten mit HCC im Zusammenhang mit HBV.Hepatitis-B-assoziierte Zirrhose und HCC-Patienten identifizierten einen siRNA-Klassifikator, der sieben differentiell exprimierte siRNAs enthält, die HCC in verschiedenen Kontrollen nachweisen können;Der AUC-Bereich beim frühen Screening ist besser als bei AFP-Freiwilligen.Sie fanden heraus, dass vier miRNAs (miR-1972, miR-193a-5p, miR-214-3p und miR-365a-3p) Patienten mit HCC von Patienten ohne HCC unterscheiden konnten.Fünf überexprimierende miRNAs (miR-122-5p, miR-125b-5p, miR-885-5p, miR-100-5p und miR-148a-3p) gelten als potenzielle HBV-Infektionen insbesondere bei HCC, Zirrhose und CHB-Biomarkern miR-34a-5p können Biomarker für Leberzirrhose85 und potenzielle Biomarker für ein frühes Screening auf HCC in Hochrisikopopulationen sein.Die am besten untersuchte lncRNA in HCC ist bei Leberkrebs (HULC) hoch aktiviert.Andere Studien haben gezeigt, dass der bei HCC-Patienten zirkulierende HULC als diagnostischer Marker verwendet werden kann, da diese lncRNA bei HCC-Patienten im Vergleich zu gesunden Personen stark hochreguliert ist.71,86 Unter anderen lnRNAs gilt LINC00152 aufgrund seiner hohen AUC, Sensitivität und Spezifität als die beste diagnostische lncRNA.86 In einer Studie stieg die periphere Blutexpression von LINC00152 allmählich von normalen gesunden Kontrollen zu Patienten mit CHB und Zirrhose und war schließlich bei HCC am höchsten.Studien zur Expression von circSMARCA5 im Plasma von Patienten mit HCC haben einen fortschreitenden Rückgang der Expression bei HCC gezeigt, der von Hepatitis bis hin zu Zirrhose und präkanzerösen Läsionen reicht.87 Die Analyse von ROC-Kurven bestätigte das Potenzial dieser circRNAs bei der Unterscheidung von Patienten mit Hepatitis oder Leberzirrhose von Patienten mit HCC, insbesondere solchen mit AFP-Werten unter 200 ng/ml.Darüber hinaus analysierte Zhu 13.617 zyklische RNAs in Plasmaproben von HBV-assoziierten HCC-Patienten und bestätigte, dass 6 zyklische RNAs bei HCC- und HBV-assoziierter Zirrhose unterschiedlich exprimiert wurden, was darauf hindeutet, dass cRNAs von Vorteil sein könnten.Marker für die Früherkennung von Hochrisikogruppen wie z. B. Patienten mit Lebererkrankungen oder Sklerose.88
Exosomen sind Membranvesikel mit einem Durchmesser von 40–160 nm;mehrere intrazelluläre Vesikel verschmelzen mit der Zellmembran und werden in die extrazelluläre Matrix freigesetzt.Sie enthalten viele aktive Komponenten, darunter Lipide, Proteine, RNA und DNA, und spielen eine Schlüsselrolle bei der Kommunikation zwischen Zellen, sowohl HCC- als auch Nicht-HCC-Zellen.89,90 Exosomen regulieren das Fortschreiten von HCC, indem sie Hepatozytenfibroblasten und Sternzellen, Immunzellen, normale Hepatozyten und HCC-Zellen aktivieren.91 In der Mikroumgebung des Tumors produzieren Tumorzellen eine große Anzahl von Exosomen, die von Krebszellen zu unreifen Zellen transportiert werden, die wiederum an der Onkogenese, dem Abbau und der zellulären Signalübertragung beteiligt sind.92 Studien haben gezeigt, dass Exosomen während pathologischer Prozesse Onkogene auf normale Zellen übertragen können, was einer der Mechanismen der Tumorinvasion und Metastasierung sein kann.93 Die Rolle von Exosomen bei der Krebsprogression kann dynamisch und spezifisch für den Krebstyp sein. 89 Exosomen können von benachbarten oder entfernten Zellen internalisiert werden, um mehrere Zielgene in Empfängerzellen zu regulieren, die möglicherweise an interzellulären Kommunikationsionen und zellulären Mikroumgebungsinteraktionen beteiligt sind vermitteln zelluläre Signalübertragung und Stoffwechsel.94 Eigenschaften und dynamische Veränderungen von Exosomen-Frachtmolekülen spiegeln direkt die Eigenschaften und dynamischen Veränderungen von elterlichen Tumorzellen wider,95 was auch die Grundlage für die Verwendung von Exosomen bei der Diagnose und Prognose von Krebs sowie für die Vorhersage des individuellen Ansprechens auf eine Krebstherapie ist ..96
Herkömmliche Labormethoden zum Isolieren und Analysieren von Exosomen sind komplex, mehrstufig und zeitaufwändig, einschließlich Ultrazentrifugation, Filtration, Größenausschlusschromatographie, Immunaffinitätsreinigung, Western Blotting, enzymgebundener Immunadsorptionstest (ELISA), PCR und Durchflussanalyse.Miniaturisierte Systeme und Lab-on-a-Chip-Plattformen mit Mikro-/Nanotechnologie werden in großem Umfang für die schnelle und bequeme In-situ-Isolierung von Exosomen entwickelt.Die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) ist eine weit verbreitete Methode zur Charakterisierung der Größe und Konzentration von Exosomen, einschließlich Methoden wie magnetische Nanopartikel und Polyhydroxyalkanoate.Auch mikrofluidische und elektrochemische Methoden können Exosomen schnell und in hoher Ausbeute nachweisen.
Exosomale Proteine ​​sind wichtige Marker für die Diagnose des HCC.In der Arbelaiz-Studie war der Gehalt an 98 RasGAP SH3-bindendem Protein (G3BP) und polymerem Immunglobulinrezeptor (PIGR) in HCC-abgeleiteten Exosomen signifikant erhöht, und die mutmaßliche kombinierte Wirksamkeit der beiden Proteine ​​war der von AFP überlegen.Eisenüberladung ist ein wichtiger Faktor, der zur Entwicklung von HCC beiträgt.Tseng berichtete, dass Hepcidin eine Schlüsselrolle bei der Resistenz gegen HCC spielen könnte.99 Exosomen, die aus den Seren von HCC-Patienten gewonnen wurden, wiesen eine signifikant höhere Kopienzahl von Hepcidin-mRNA-Varianten auf als ihre gesunden Gegenstücke, was darauf hindeutet, dass Hepcidin ein neuer diagnostischer Biomarker für HCC sein könnte.Das 14-3-3ζ-Protein in Exosomen, das von 100 HCC produziert wird, kann die T-Zell-Aktivierung, -Proliferation und -Differenzierung reduzieren und eine T-Zell-Transformation in regulatorische T-Zellen induzieren, was zu einer T-Zell-Verarmung führt.101 Dies wird durch mehrere Studien gestützt, die die Tumorumgehung aus der Immunüberwachung untersuchen, 102 die zur HCC-Tumorentstehung beitragen kann.
Zusätzlich zum Vorhandensein von ecRNA in Plasma oder Serum können RNA-angereicherte Exosomen für das nicht-invasive Echtzeit-Staging beim frühen Tumor-Screening und zur Bestimmung der Tumorentwicklung und des Ansprechens auf die Therapie verwendet werden.Der Spiegel von exosomaler miRNA-21 im Blutserum war in der HCC-Gruppe 2,21-mal höher als in der CHB-Gruppe und in der HCC-Gruppe 5,57-mal höher als in der gesunden Bevölkerung.In der Wang-Studie erhöhten Exosomen signifikant das HCC im Vergleich zu Zirrhosepatienten mit AUC-Werten von 0,83 (95 % CI 0,74–0,93) und 0,94 (95 % CI 0,88–1,00).104 Die erhaltenen Daten verdeutlichten die Beteiligung spezifischer exosomaler Cargo-Moleküle an der Regulation der Onkogenese und der HCC-Progression.105 Die Serumexpression von miR-221, miR-103, miR-181c, miR-181a, miR-93 und miR-26a ist konsistent.und Metastasierung, und die miR21-Spiegel waren bei HCC-Patienten viel höher als bei gesunden Kontrollpersonen und auch bei CHB-Patienten.102 LncRNA hatte potenziellen diagnostischen Wert bei HCC.Studien haben gezeigt, dass Exosomen, die aus den Seren von HCC-Patienten stammen, signifikant höhere Konzentrationen von LINC00161, LINC000635 und lncRNA aufweisen, die durch transformierenden Wachstumsfaktor-β aktiviert wurden, als bei Patienten ohne HCC, und diese lncRNAs sind stark mit dem TNM-Stadium und dem Tumorvolumen assoziiert.110 Conigliaro et al.Es wurde festgestellt, dass CD90+-Exosomen hohe Konzentrationen von lncRNAH19 exprimieren, was die Freisetzung des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) und die VEGF-R1-Rezeptorproduktion signifikant erhöhte und dadurch die Angiogenese stimulierte.93 CircRNAs sind eine andere Art von exosomalen ncRNAs – sie werden artübergreifend in niedrigeren, aber stabilen Mengen exprimiert, circRNAs zeigen auch Spezifität für Zelltyp, Gewebetyp, Entwicklungsstadium und regulatorische Aktivität.111 circRNAs sind diagnostische Biomarker für frühen und minimal-invasiven Krebs.112 Jüngste klinische Studien haben gezeigt, dass die Spezifität einzelner miRNAs bei der Vorhersage von HCC nicht ideal ist.Daher kann ein komplexer Nachweis mit mehreren Assays (z. B. miR-122 und miR-48a in Kombination mit AFP) die Identifizierung von frühem HCC und die Differenzierung von HCC und Zirrhose verbessern.100
Patienten mit CHB und Leberzirrhose sind die häufigste Hochrisikogruppe für die Entwicklung eines HCC.Für Hochrisikogruppen sollte nach Erreichen eines anhaltenden virologischen Ansprechens eine kosteneffiziente Überwachungsstrategie basierend auf dem HCC-Risiko entwickelt werden, und ein frühes Screening ist der Schlüssel zur Verbesserung der Diagnose und Behandlung von HCC mit einem hohen Kosten-Nutzen-Verhältnis2 ..Früherkennungsmethoden für Krebs haben viele Einschränkungen: Für die meisten Krebsarten wurden keine wirksamen Früherkennungsmethoden entwickelt, und die Therapietreue ist in der Regel gering.Im Vergleich zu herkömmlichen frühen Screening-Methoden hat die Flüssigbiopsie-Technologie offensichtliche Vorteile: einfache Probenahme, Panrac-Erkennung, gute Probenreproduzierbarkeit und effektive Reaktion auf Tumorheterogenität.Angesichts der Kosteneffektivität der mit der Flüssigbiopsie verbundenen Methoden wurde ihre Verwendung beim HCC-Screening nicht routinemäßig getestet.Trotz Fortschritten bei der genauen Erkennung auf molekularer Ebene ist die Flüssigkeitsbiopsie zum Nachweis von HCC bei Zielpatienten kostspielig, was ihre weit verbreitete Verwendung im Vergleich zu spezifischen bildgebenden Verfahren wie Ultraschall und Magnetresonanztomographie einschränkt.113,114 Eine frühere Studie zeigte jedoch, dass die Flüssigbiopsie einen signifikanten Vorteil in Bezug auf die qualitätskorrigierten Lebensjahre (QALYs) zeigte.115 Die Vorteile der Flüssigbiopsie bei frühen Karzinomen des Magens und Nasopharynx wurden ebenfalls gezeigt.116,117 Die derzeitige Ansicht ist, dass Flüssigbiopsie Serum-Biomarker und radiologisches Screening bei der Erkennung und Diagnose von Tumoren ergänzen kann.117 118
Laut aktueller Literatur hat die Flüssigkeitsbiopsie-Technologie eine signifikant höhere Sensitivität und Spezifität bei der Früherkennung von Hochrisikogruppen für Leberkrebs gezeigt.Unabhängig von der Art der Flüssigkeitsbiopsie kann HCC von Personen mit hohem Risiko ohne HCC unterschieden werden, was auf die Bedeutung eines frühen Screenings hindeutet, da Unterschiede zwischen Personen mit hohem Risiko und gesunden Personen offensichtlich sind.ctDNA hat eine kurze Halbwertszeit und kann zum Nachweis von HCC verwendet werden, sodass alle Veränderungen in der cDNA aus Tumoren in Echtzeit konkrete Hinweise auf eine Tumorprogression liefern können, insbesondere bei kleinen Tumoren.Ein hoher ctDNA-Spiegel zeigt die Entwicklung und Ausbreitung von Krebs an und ist ein früher Indikator für Progression und Rezidiv.Darüber hinaus können Patienten basierend auf den Ergebnissen der ctDNA eine individualisierte Behandlung und Nachsorge erhalten.119 Spezifische Methylierungsstellen können ein besserer Marker als AFP für die Früherkennung von HCC und zirrhotischen Knötchen sein.In resektablen Fällen von HCC weisen hohe cDNA-Spiegel auf eine mikrovaskuläre Invasion und postoperative Rezidive und Metastasen hin.Änderungen der Kopienzahl sind mit dem Überleben von Patienten mit HCC assoziiert.Es kann davon ausgegangen werden, dass die cDNA-Evaluierung an der Gesamtbehandlung des HCC beteiligt sein kann und cDNA als effektiver Indikator für die therapeutische Modulation dienen kann.Marker, die auf spezifischen genetischen Mutationen in ctDNA basieren, wurden von klinischen Richtlinien übernommen, um die Wirksamkeit vorherzusagen und die Arzneimittelresistenz zu überwachen.ctDNA-Tests können das nützlichste Flüssigbiopsie-Tool für ein frühes Screening sein.CTCs spielen auch eine Schlüsselrolle bei der Früherkennung von Hochrisiko-HCC-Gruppen.Verschiedene Marker von HCC-assoziierten CTCs sind von besonderer Bedeutung für den Beginn, die Entwicklung und das Wiederauftreten von HCC.Als Membranvesikel sind Exosomen an der interzellulären Kommunikation beteiligt, insbesondere in HCC-Zellen.Zirkulierende microRNAs sind im Blut stabil und können daher für ein frühes Screening auf HCC nützlicher sein.Nach und nach wurden exosomale Proteine ​​und RNA-reiche Exosomen entdeckt und ihre prädiktive Wirksamkeit für HCC bestätigt.Interessanterweise können auch unterschiedliche Ätiologien des HCC mit unterschiedlichen Mutationen assoziiert sein, sodass wir basierend auf unterschiedlichen Ätiologien des HCC unterschiedliche Biomarker für ein frühes Screening auswählen können.120
Allerdings sind aktuelle Fluidbiopsie-Techniken in Bezug auf Stabilität fragwürdig und können ein frühes Screening oder Monitoring von HCC nicht eigenständig durchführen, aber dennoch individuelles Screening und Diagnose ergänzen.121 Als eine Form der Flüssigbiopsie haben der Nachweis und die Bildgebung von ctDNA, CTC, cfRNA und Exosom-assoziiertem AFP oder PIVKA-II vielversprechende Anwendungen in der Frühdiagnose und Prognose von HCC.Der genaue Mechanismus der ctDNA-Freisetzung ins Blut muss jedoch noch aufgeklärt werden.Die Aufdeckung der grundlegenden biologischen Eigenschaften von ctDNA kann ihre Verwendung als Marker erleichtern.Die geringe Menge an ctDNA im Kreislauf und die strengen Anforderungen an die Probenhandhabung sind Herausforderungen für die klinische Umsetzung des cDNA-Nachweises beim HCC.Darüber hinaus weisen genetische Mutationen keine spezifischen Merkmale auf, die eine genaue Identifizierung von Karzinogenen ermöglichen.Da mehrere genetische und somatische Varianten auch in normalen Geweben vorhanden sind, können durch Flüssigkeitsbiopsie identifizierte genetische Mutationen beim frühen Screening auf HCC von begrenztem Nutzen sein.122 Die Einschränkungen gut definierter nützlicher Genziele und Biomarker, die helfen, cDNA von Nicht-Tumor-DNA zu unterscheiden, sind die wichtigsten Probleme bei der Verwendung von cDNA.Mangel an Nützlichkeit sensitiver und spezifischer Marker für den Nachweis von CTCs.Es wurden nur lebensfähige Zellen mit metastasierendem Potenzial gefunden, und die optimale Kombination von CSC-angereicherten Markern war unklar.Die Isolierung von CTCs für die Kultur und die Bewertung ihrer Mutationsprofile ist ebenfalls eine herausfordernde Aufgabe.Aufgrund von Problemen bei der Identifizierung, Isolierung und Reinigung von Exosomen ist der spezifische molekulare Mechanismus noch unklar, und frühere Studien zum Mechanismus von Exosomen und HCC und zur Art und Weise, wie miRNAs, lncRNAs und Proteine ​​​​in Exosomen sortiert werden, waren nicht tiefgreifend , und es ist nicht klar, ob die Exosomenaufnahme ein spezifischer Prozesstyp ist.Die Verwendung von Exosomen zur Diagnose und Behandlung des HCC befindet sich noch im präklinischen Stadium.Der Mangel an Standardisierung von Flüssigbiopsieverfahren, wie z. B. die Art der Röhrchen, die zur Blutentnahme verwendet werden, Blutvolumen, Probenlagerung und -nachweis, Isolierung und Anreicherung, kann ihre Verwendung in der klinischen Routinepraxis aufgrund von Unterschieden in der Praxis in den medizinischen Zentren ausschließen.Die Wirksamkeit der Flüssigbiopsie bei der Früherkennung, Diagnose, Wirksamkeitsbewertung und Vorhersage von HCC muss noch untersucht werden, insbesondere für Hochrisikogruppen.Die Flüssigbiopsie-Technologie hat ein großes Potenzial und wird voraussichtlich in naher Zukunft in der klinischen Praxis von Leberkrebs weit verbreitet sein.
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